学习亲和层析法制备乳酸脱氢同工酶的原理和方法；学习并掌握乳酸脱氢酶同工酶的测定方法 和原理。

      利用辅酶及其衍生物、抑制剂或激活剂作为配基，通过“间隔臂”与活化的琼脂糖凝胶载体共价偶联成亲和吸附剂，采用亲和层析法分离乳酸脱氢酶同工酶。

1.试剂 5^/ -AMP-8(6-氨基己基)胺、QT₄、乙腈、溴化氢、碳酸缓冲液、NaCl溶液 、4mol/L及1mol/LNaOH、磷酸氢二钾 — 磷酸二氢钾缓冲液、硫酸铵、尿素、NAD⁺—丙酮酸钠加成物亲和洗脱液。

2.器材   玻璃烧结漏斗，pH计、电磁搅拌器、摇床、紫外分光光度计、组织捣碎机、冷冻离心机、层析柱、自动收集器、紫外监测仪、梯度混合器。

     1. 5^/ -AMP-8(6-氨基己基)氨基Q T₄亲和层析介质的制备 （1）配制配基溶液 配200mg 5^/ -AMP-8(6-氨基己基)胺的水溶液；（2）预处理QT₄ NaCl洗涤，抽滤成饼状；（3） 活化QT₄ ；（4）偶联

    2.亲和层析分离LDH（1）制备组织提取液：制备猪骨胳肌及猪心的组织提取液；（2）亲和吸附合并有活力的，测出为吸附的LDH活力；（3）亲和洗脱 留样测活，蛋白质含量计PAGE鉴定；（4）亲和介质的再生与保存

    3.LDH活性测定

    4.蛋白含量测定

    5.PAGE鉴定LDH纯度

    测活时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中预热。操作时应注意酶的稀释度及加入量，控制在△A₃₄₀/min0.1-0.2之间。

 1.亲和层析法的原理是什么？

 2.分离乳酸脱氢酶同工酶的原理是什么？