实验类型：综合
学　　时：25(参考)

内　　容：

1、学习碱裂解法质粒提取过程以及各种纯化步骤的原理；

2、掌握提取质粒实验过程中的各项基本实验技术；

3、学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；

4、学习琼脂糖凝胶电泳检验核酸的方法。

    碱裂解法提取质粒：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

    限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。
    琼脂糖凝胶电泳：是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。琼脂糖凝的浓度影响给定大小的线状DNA的迁移率，因此采用不同浓度的凝胶可以分离不同大小范围的DNA片段。

试剂  含有质粒 pUC18的E.coli JM109
NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)
EcoR1 和 Xho1 核酸内切酶（Takara）
琼脂糖
溴化乙啶染色液(10mg/ml)
上样液(6×)：0.25% 溴酚兰，40％(W/V)蔗糖 水溶液或30％的甘油。

6、  器材  电泳仪，电泳槽，紫外透射仪，凝胶成像仪，一次性塑料手套等 .

1. 提取质粒DNA

配制培养基，灭菌后加入氯霉素，接种含有pUC18质粒的E.coli JM109；37℃振荡培养；

离心收集细菌，加入溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ裂解细菌；

加入饱和酚、氯仿－异戊醇分离、纯化质粒pUC18；

加入异丙醇沉淀质粒DNA；

TE溶解质粒。

2.限制性核酸内切酶EcoR1 和 Xho1 切质粒pUC18；

    加入水、缓冲液、DNA、酶，离心混匀后酶切。

3.电泳检验纯化质粒与酶切产物。

制胶、点样、电泳、染色观察、照相并分析结果。

1．溶液Ⅰ加入后要充分混匀、悬浮。

2．溶液Ⅲ加入后要轻轻颠倒混匀。

3．酚抽提后要小心吸取上清夜，防止将蛋白吸取上来。

4．酶切时的加样顺序为：水＋缓冲液＋DNA＋酶，保证酶的活性。

5．琼脂糖要充分溶解。

6．点样要迅速。

7．电泳时电压保持在5V/cm。

1、裂解细菌时需注意的事项有哪些？

2、碱裂解法提取质粒DNA中溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的作用是什么？

3、抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？

4、如何提高质粒DNA的产量？

5、限制性核酸内切酶的酶切位点是？

6、试述EB显色的原理？