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实验题目：干扰素测定实验
教 师：XXX
实验类型：基础
学 时：8(参考)
内 容：
一、实验目的：
1．掌握干扰素测定的实验方法。
2．了解一些细胞因子（如IL、TNF、CSF等）的常规检测方法
二、实验原理
干扰素(IFN)根据其产生细胞不同和理化性质、生物学特性的差异可分为α干扰素(IFN-α)、β干扰素(IFN-β)和γ-干扰素(IFN-γ)。它们在机体免疫调节、抗病毒感染中具有重要作用。检测IFN的方法主要分为定量测定(常用ELISA)和生物学活性的检测，后者较为常用。
干扰素能刺激某些指示细胞(如人羊膜上皮细胞Wish株、人喉癌细胞株Hep-2以及人胚肌皮或肺单层细胞)产生抗病毒蛋白，从而使细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)的攻击，根据待测样品不同稀释度的保护能力，计算出干扰素生物学活性单位。
三、试剂与器材
1.VSV
2.WISH、HeP-2细胞株或人胚肌皮或肺单层培养物。
3.MTT[3-(4,5二甲噻唑-2-yl)-2,5-2苯基-四唑溴盐]，二甲亚砜(DMSO)，刚果红，结晶紫等。
4.10％FCS RPMI1640, 培养板、培养瓶、CO?孵箱、超净台、酶联检测仪。
四、操作方法
1.96孔培养板中加入不同稀释度的IFN和标准IFN，每个稀释度设3孔，每孔50μl，病毒对照不加IFN。
2.每孔加入100μl 1.5～2×10５／ ml Wish或Hep-2细胞悬液，37℃、CO2?孵箱培养6～12h，使细胞贴壁为单层。
3.每孔加入50μl含100个 TCID50 VSV,细胞对照不加病毒液。
4.根据细胞病变状态，终止培养前3～4h加入5mg／ml MTT, 15μL／孔。
5.加入适量生理盐水，用滴管轻轻吹吸弃去悬浮病变细胞和死细胞。
6.200μl／孔 二甲亚砜(DMSO)，作用10min。
7.测OD(570nm),表示活细胞中含干扰素的量。也可用刚果红摄入法、结晶紫染色法测定IFN对活细胞的保护水平。
9.计算:以保护半数(50％)细胞免受病毒损害的最高干扰素稀释度为1个干扰素活性单位。也可从标准曲线中求得待测样品的IFN活性单位。
五、关键步骤与注意事项
1、实验时先加IFN，后加指示细胞，以使细胞均匀分布于培养板底部。
2、本法对天然培养上清或重组IFN-α、IFN-β和IFN-γ均可检测其活性单位。
3、培养板应处理干净，否则将会影响L929细胞的贴壁
4、融解后的VSV不宜在室温放置较长时间，这样会使病毒失活
六、思考题
1．动物细胞的培养需要注意那些问题？
2．本实验是如何设立阴、阳性对照的？
3．本实验加入MTT的作用是什么？
4．为什么要去处病变细胞和死细胞？
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