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实验题目：免疫细胞凋亡检测
教 师:XXX
实验类型：综合
学 时：12 (参考)
内 容：
一、实验目的：
细胞凋亡与细胞生长发育和分化密切相关，也为基础医学，药物筛选和治疗提供理论依据和靶点选择基础。
二、实验原理：
体外培养的活细胞经荧光色素染色，荧光显微镜下观察呈均匀荧光染色，而凋亡细胞呈致密浓染的颗粒状和块状荧光，可在荧光显微镜下看出明显差异。常用荧光色素有：①吖啶橙；②Hoechst33258；③Hoechst33342;④碘化丙啶（PI）；⑤溴化乙啶（EB）。前三种可进入活细胞和死细胞，而后两种仅能进入死细胞。
细胞经裂解消化后按常规法提取DNA，在含EB的琼脂糖凝胶中电泳，正常细胞基因组DNA呈单一条带；细胞凋亡时DNA呈典型的梯状条带；坏死细胞DNA则为无规律断裂带形成的模糊的、弥散状条带。
末端标记法，ELISA检测法，流式细胞仪法原理参看《免疫学实验技术》P139。（柳忠辉，吕昌龙主编，科学出版社出版）
三、试剂与器材：
切片机、荧光显微镜、电泳设备、流式细胞仪等
四、操作方法：
1、石腊组织切片
2、染色
3、荧光显微镜观察
4、ELISA检测
5、琼脂糖凝胶电泳
6、末端标记
7、放射自显影分析
8、流式细胞仪检测技术
五、关键步骤与注意事项：
1、避免同位素污染
2、用Heochst33342染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在20分钟之内为宜。若太长，可引起Heochst33342的发射谱由蓝光向红光迁移，导致红色荧光与蓝色荧光比例改变，从而影响结果的判断。
六、思考题：
1、比较各检测方法在原理上有何差异？
2、各方法操作在哪些地方会影响实验结果？
3、考虑灵敏度、安全和实验室具体情况，你觉得采用什么方法为好？
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