2.活化血小板的标志物：活化血小板与静息血小板相比，其质膜糖蛋白常发生显著的变化，这些变化的糖蛋白便成为活化血小板的检测标志物,这些标志物可分为三类：第一类是血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白，如CD62、CD63，在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。第二类是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如GPⅡb/Ⅲa(CD41/61)的PAC1表位，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。因此，使用这个表位的荧光单抗，我们能更精确地在更早阶段检测到血小板的活化。另外，GPIV (CD36)虽然在静息血小板上也表达，但活化血小板上表达量更高；GPIb-IX-V复合物(CD42)则相反，与静息血小板相比，活化血小板上表达量显著降低。第三类是出现在活化血小板上能与血小板表面受体相结合的一些抗原，包括纤维蛋白原，Xa因子和thrombospondin等。这些抗原在血小板表面的出现和消失在临床检测上也是有意义的。

3. 除检测免疫性的分子标志物外，流式细胞术还能检测一些反映活化血小板功能的非免疫性指标。如用Ca2+浓度敏感的荧光染料检测胞内Ca2+流，用能进入血小板致密颗粒的荧光染料阿的平来检测活化血小板的释放功能等。

4. 单抗的选择：与血小板有关的CD单抗有CD9，CD31，CD36，CD41a-b，CD42a-d，CD61（特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血小板结合。CD61与CD41联合，即为血小板表面gpⅡb/Ⅲa复合物），CD62，CD63 ，CD107a-b等，。活化血小板的检测需选择针对活化血小板标志物的CD单抗。表2列举了活化血小板检测的一些代表性单抗。

表2　活化血小板CD单抗简介

 

CD单抗	代表性单抗	识别的膜糖蛋白
CD36	5F1，CIMeg1，ESIVC7	GPIV
CD41	PAC1，7E3，PBM6.4	GPⅡb/Ⅲa和GPⅡb
CD42a	FMC25，BL-H6，GR-P	GPⅠ
CD42b	PHN89，AN51，GN287	GPⅠ
CD61	Y215，CLB-thromb/1	GPⅢa
CD62	CLB-thromb/6,RUU-SP1.18.1	P-selectin或GMP140
CD63	RUU-SP2.28，CLB-gran/12	GP53

三、操作步骤

1.标本采集：

(1)枸橼酸钠抗凝的真空采血管顺序编号。

(2) 抽取静脉血，采血管中注入2ml。

(3)于10分钟之内完成血小板激活和染色步骤，操作时应注意减少人工激活。

2.血小板激活：

(1)试管内加入50mlADP（也可选用其他激活剂，如PMA、纤维蛋白、TRAP），450ml全血，轻轻摇匀。

(2)室温孵育5分钟。

(3)立即染色。

3.荧光抗体染色：

(1)Falcon管编号。

(2)在对照管中加入同型对照、CD61、PAC－1和RGDS（PAC－1的阻断剂）。

(3)在试验管中加入CD62P、CD61和PAC－1。

(4)在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本5ml。

(5)轻轻混匀，室温暗处孵育15-20分钟。

(6)各管中加入1ml冷的固定液 (2-8°C)，充分混匀， 2-8°C阴暗处放置30分钟。

(7)24小时内上机分析。

4.结果分析：

在CD61 vs SSC点图中设门找血小板群。 CD61 vs SSC 点图显示有三群，

CD61阳性/低SSC一群主要由单个血小板组成，CD61阳性/高SSC一群主要由黏附血小板的血细胞组成， CD61阳性/散射光更低的一群主要由血小板来源的

碎片组成。由于在生理和病理情况下，血小板群和红细胞群的大小、颗粒度会有交叉，因此，不建议使用FSC-SSC图设门。    在CD61 vs SSC点图中找出CD61 阳性的血小板群 (单个血小板和黏附在WBC上的血小板)，设门。

1.采血时请用大号针管，抽出的前2ml血应弃去不用。

2.尽量避免标本受到物理振动。

3.取血后10分钟内完成染色操作。

4.在Falcon管中加血标本5ml，管壁上不能有残留血，未染色的部分会影响试验结果。

5.为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控制。