一、实验目的：

1、掌握两栖动物外周血淋巴细胞培养的基本方法。

2、对细胞培养获得的染色体进行观察。

3、提高学生实验素质，培养学生学研究和创造性能力。

二、实验条件：

1、材料：两栖动物（蟾蜍）

2、仪器：显微镜、超净工作台、培养箱、离心机、恒温水浴锅、冰冻玻片、离心管（10ml） 、注射器、针头（5号）、吸管、酒精灯、微孔滤器、滤膜、培养瓶、解剖盘、解剖剪、镊子、量筒等。

3、药品：0.2%肝素钠、RPMT1640培养基、植物血凝素（ PHA ）、0.1%秋水仙素、0.075M KCl、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液、磷酸缓冲液(PH7.4) 等。

4、培养基：（1）RPMI1640培养基     4ml

          （3）双抗(青霉素和链霉素)各 2.5μl

（青霉素和链霉素浓度20万U/ml）

          （4） PHA    0.15ml （浓度1mg/ml） 用5%NaHCO3调PH值为7.2，过滤灭菌。

三、实验要求：

1、选择染色体清晰，分散好的中期分裂相，计数染色体，显微摄影、并打印出照片。

3、PHA的作用是什么？本次实验为什么低渗温度选择26℃，而在小鼠骨髓细胞染色体制片中低渗温度选择在38 ℃？

4、写出实验报告。

四、使用说明

血细胞培养是制备人和珍稀、濒危动物等染色体标本的主要方法之一，动物外周血淋巴细胞一般情况下不进行分裂。如果在培养液中加入一种强有力的有丝分裂原----植物血凝素（PHA），这种淋巴细胞受到刺激可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂。

实验方案、步骤由同学自己设计。