与基因转录启动有关的一组DNA序列，一般位于RNA poII转录起始点上游100-200bp以内，其功能是决定转录的起始点和调控转录频率．
  启动子区域包括核心启动子和启动子上游近侧序列：
1、核心启动子(core promoter)
是决定转录起始位置的关键序列，也是普通转录因子TFⅡD的结合位点，
①TATA盒(TATA box)  位于转录起始点上游-25～-30bp．
②起始子(initiator，Inr)  Inr是与转录起始位点重叠的短的较保守序列．
注：①不是所有基因都含有TATA盒或Inr序列．有的只有其中之一，有的两者都无．
     ②这些核心启动子的序列和它们之间的间隔多变
2、上游启动子元件(Upstream Promoter element，UPE)
  位于较上游(-30一-110bp)，能较强影响转录起始的频率，如CAAT 盒和GC盒．其中GC盒是转录因子SPl的结合位点。
(二)RNA聚合酶Ⅱ
    负责真核生物蛋白编码基因的转录(产物mRNA)，有7-10个亚基，最大亚基的羧基末端结构域(CTD)具有7个氨基酸(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser -Pro-Set)的重复序列，其中有多个磷酸化位点．CTD磷酸化对调控基因转录有重要作用．
(三)基础转录因子(basal transcription factor)
  真核基因转录除RNA聚合酶外还需要许多蛋白因子—转录因子参加，其中一些转录因子是RNA聚合酶Ⅱ转录起始必需的，并且可以维持基础水平的转录，因此称为基础转录因子或普通转录因子(general transcription factor)
1．RNA聚合酶 II的普通转录因子(TF II)
包括TFIID,TFⅡB,TFIIF，TFIIE，TFIIH，TFIIA等．
TFIID是由TATA盒结合蛋白(TATA binding protein，TBP)和8种TBP协同因子(TBP associated factor，TAF)组成的复合物，TFIID可识别和结合核心启动子(TATA盒和Inr)；
TFⅡB的C端与TFIID和DNA的复合物结合，N-端与TFⅡF协同作用募集RNA聚合酶II，再加上TFIIE,TFIIH形成完整的转录复合物．
  TFIIH有蛋白激酶活性，可使RNA Pol最大亚基CTD磷酸化，使转录起始过渡到转录延伸．   
  TFIIA有助于TFIID与TATA盒核心启动子结合．
2、TAF的作用
  TFIID中包括至少8种TBP协同因子,分子量为30—250kD,分别命名为TAFⅡ-30～250．
TAFⅡ150识别起始子(1nr)序列．
TAF是基因转录调控的辅助因子，它的作用是通过与多种转录调控因子（激活物或阻遏物）的转录调控结构域结合，而介导转录激活或抑制。
二、基因转录的顺式调控元件
    顺式调控元件(cis-regulating element)是指对基因表达有调控活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因．
    顺式调控元件中的短核心序列：共有序列或一致序列（consensus sequence)。
  (一)启动子(promoter)
  (二)增强子(enhancer)
    能显著提高基因转录效率的一类顺式调控元件（其核心序列常为8-12bp)．
  增强子的作用特点：   
  1．能(通过启动子)提高同一条链上的靶基因转录速率；
  2．增强子对同源基因或异源基因同样有效；
  3．增强子的位置可在基因5’-上游、基因内或3’下游序列中；
  4．自身没有5’-或3’-方向性；
  5．增强子可远离转录起始点(最多30Kb)；
  6．增强子一般具有组织或细胞特异性．
(三)负调控元件—沉寂子   
    负调控元件是能抑制基因表达的序列．如沉寂子(silencer)
(四)其它顺式调控元件
  1．应答元件(responsive elements)
     真核细胞中对某些特定的环境作出应答的基因，常具有相同的顺式元件—应答元件．
     应答元件能被在一些特定情况下表达的调控因子识别(又称为可诱导的顺式调控元件／反式作用因子)。
  2．转座元件对基因表达的调控，    。
三、基因转录的反式作用因子
  转录水平的调控主要是通过与多种DNA元件结合的蛋白因子来实现．
  反式作用因子(trans-acting factor)是通过识别和结合顺式调控元件的核心序列而调控靶基因转录效率的一组蛋白质．
  反式作用因子对基因表达的调控可正(激话)可负(阻遏)．
  (一)反式作用因子的结构：   
  结构域(domain)是指蛋白质中可以具有独立的超二级结构的部分。通常由一个基因外显子编码，并可具有特定的功能。在较大的蛋白质中， 多个结构域间可通过较短的多肽柔性区互相联接．
  基序(motif)：一般指构成任何一种特征序列的基本结构．作为结构域中的亚单元，其功能是体现结构域的多种生物学作用．
1．反式作用因子的DNA结合结构域(DNA binding domain)中的几种常见基序：
  ①螺旋/转角/螺旋（Helix-turn-helix,HTH）基序
两段螺旋被一短的转角结构分开，其中一段螺旋为DNA识别螺旋．
    同源异形结构域(Homeodomain，由同源异形盒编码)中含有HTH基序。具有Homeodomain的转录调控蛋白在胚胎发育和正常细胞分化的基因表达调节中有重要作用。
②锌指(Zinc finger)基序
    由肽链的保守序列中的一对组氨酸加一对半胱氨酸(His2／Cys2)或2对半胱氨酸(cys2／cys2)与一个锌离子形成配位键，这些氨基酸对之间的多肤链成环状突出并折迭成指形结构，多个指结构常串联重复。
  锌指族转录因子以二聚体形式同DNA上的顺式调控元件结合。
  含锌指基序的转录因子：与GC盒结合的SPl、类固醇激素受体家族，抑癌蛋白WT1等。
③亮氨酸拉链(Leucine-Zipper)基序
    由一段每隔6个a a 就有一个Leu的伸展肽链组成，这些周期性出现的Leu都位于α—螺旋的同—侧面，因此两条均含Leu拉链基序的蛋白质通过亮氨酸侧链的相互作用形成二聚体。
    具有亮氨酸拉链基序的转录因子：原癌基因C-Jun/C-fos(APl家族)
④螺旋-环-螺旋(Helix-loop-Helix，HLHt)基序．
  由2个α螺旋间隔一个非螺旋的环(loop)组成．
如原癌基因产物C-myc及其结合蛋白Max．
含HLH和Leu-拉链基序的转录因子的相似性：
①均至少含有一个α螺旋，其中都有一侧亲水面和一侧疏水面，因此这两种基序又称为两亲α—螺旋基序．
②两类转录因子均依靠α螺旋氨基端附近的碱性区（带正电荷aa区）与DNA结合，因此又分别称为bzip和bHLH （b=basic，碱性)
③两类转录因子活性都依赖于二聚体化
2、反式激活结构域(Transactivation domain)    ‘
  是反式作用因子的转录调控结构域，一般由DNA结合结构域外的30-100个aa组成．
  常见的反式激活域有以下几种：
①酸性α谨螺旋结构域(acidic a-Helix domain)如Jun；
②富含谷氨酰胺结构域(glutamine—rich domain)如SPl．
⑧富含脯氨酸的结构域(proline-rich domain)。
(二)反式作用因子家族
    同一类序列特异性转录因子一般由基因家族编码，它们的蛋白结构同源，并结合特异的顺式调控元件，这些蛋白组成一个反式作用因子家族。
1．POU家族
  这一家族中都有一个独特的DNA结合结构域-POIJ结构域．
POU结构域包括：
    N端POU特异结构域(POUs)+C端POU同源异形结构域(POUH）．
  POU结构域是Pit1，octl／oct2和unc86等反式作用因子共有的保守区，因此这类蛋白统称为POU结构域蛋白。
2、类固醇激素受体家族
包括：糖皮质激素受体(GR），性激素受体(ER／AR)，甲状素激素受体 (TR)，维甲酸受体(RAR)，VitD3受体(VD3R)．
    这些受体位于胞质或核内，通过激活基因转录起作用．这些受体的DNA结合结构域都含有2个Cys2／Cys2型锌指基序，(分别由2个外显子编码)，可识别DNA上的激素应答元件(HRE：Hormone responsive elements)
3、NF-κB家族   
  包括RelA(P65)，P60，RelB，C-Rel，P50五种．主要是P50／RelA异二聚体．
  胞质中P50／RelA·Iκ B抑制蛋白(失活状态)→释放Iκ B而被激活→易位至核内→激活转录。

第三节  转录后加工

     在细胞核内对基因产物(mRNA前体)进行各种修饰、剪接和编辑，使编码蛋白质的外显子部分连接成为一个连续的开放读框(open reading frame，ORF)的过程称为转录后加工．

一、mRNA前体加工的分子机制    -
  核内mRNA前体—异质性核RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)，
hnRNA与蛋白质结合形成核异质性核糖核蛋白(hnRNP), mRNA前体的加工在hnRNP上进行．
(一)5’-端加帽(capping) —mRNA前体的5’-端加甲基化鸟苷(m7pppN)
    5’端m7G帽子结构的作用：
   1．使mRNA更稳定
   2．增加蛋白质合成的效率
   3．帽子结构对mRNA前体的剪接是必需的
（二)3’-端接多聚腺苷(poly(A)) —在mRNA前体3’端接上一个约200—250个腺嘌呤核苷酸(A)的尾巴。
    poly(A)尾巴的作用：
 1．有利于mRNA通过核孔；
 2．参与稳定mRNA；
 3．增强翻译效率。
（三)mRNA前体的剪接
   剪接(sp!icing)—剪除内含子，并将外显子连接
1．真核内含子的序列特征：
    真核内含子总是由Gu开始，以AG结束，内含子的5’-端剪接点(供位)和3’-端剪接点(受位)，以及内含子中的一个内部序列分支点（branch site)是mRNA前体正确剪接所必需的。
2．mRNA前体的剪接机制
  -剪接过程由二步连续的转酯反应组成．该过程中产生一个套索状中间体（ lariat intermediate)，结果使2个原先被分隔的外显子连接。
3．剪接体(spliceosome)
  细胞核内的小分子RNA(一般≤300碱基)—SnRNA（small nuclear RNA)，包括U1—U6等。 snRNA与特异的蛋白质形成复合物-SnRNP．mRNA前体与snRNP形成的复合物—剪接体．mRNA前体的剪接通过剪接体进行。   
    U2，U6，U4／U6 SnRNP等是活性剪接体的主要成份．
(四)RNA编辑(RNA editing)   
是一种与mRNA剪接不同的加工方式，指mRNA在转录后因插入、缺失或核苷酸的替换，改变了DNA模板来源的遗传信息，从而翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质，
   RNA编辑的例子：apo—B的编辑：C→U替换。
二、内含子的选择性剪接
    选择性剪接(alternative  splicing)：在mRNA前体的剪接过程中，参加剪接的外显子可以不按其线性次序剪接，内含子也可以不被切除而保留，即一个外显子或内含子是否出现在成熟mRNA中是可以选择的，这种剪接方式称为选择性剪接。此外，不同的启动子或不同的poly(A)加尾位点的选择，也可看作选择性剪接．
    选择性剪接的主要方式。
    由来自一个基因的mRNA前体因选择性剪接而产生多种mRNA，并翻译出的不同蛋白质，称为同源异构体(isoform)．
>5%的人基因可在不同的组织或生理状态下，通过选择性剪接产生不同的蛋白质异构体，这是造成真接生物高度异质性的基础。

第四节  翻译水平调控

一、翻译起始因子(IF)的调节：可逆磷酸化的作用．
    1．eIF-4F的磷酸化激活蛋白质的合成．
    2．eIF-2的磷酸化引起翻译起始受阻，降低蛋白质的生物合成水平

二、mRNA结构与翻译控制   

（一)5’-UTR结构
1、mRNA5’端m7G帽有增强翻译水平的作用．
2、“上游AUG密码子”(位于起始AUG上游的其他AUG密码子)的存在往往抑制下游开放读框的翻译效率．
3、起始AUG旁侧序列对翻译效率的影响．Kozak序列：GCCAUGG
(二)3’-UTR结构
   1．poly(A)尾增加翻译效率
   2．富含UA序列抑制翻译。
三、mRNA稳定性与翻译控制
   mRNA稳定性主要取决于3’—UTR结构
   1．poly(A)尾增加mRNA稳定性，
   2．3’-UTR中UA序列导致mRNA不稳定．
四、翻译后修饰
   1.氨基酸侧链的共价修饰：乙酰化、磷酸化、糖基化（N-、O-）；
   2,蛋白质前体的切割和成熟。Proprotein→protein.例：胰岛素的成熟。
五、蛋白质的分泌和胞内定位
 信号肽：作为蛋白质定位信号的短肽序列，指导蛋白质运输到正确位置，定位结束后通常被特异的信号

肽酶切除。
常见几种信号肽的特点：
1内质网和细胞分泌信号：N-端约20个左右氨基酸，疏水。
2 线粒体定位信号：N-端，一面为正电残基另一面为疏水残基的两亲α螺旋。
3 核定位信号：内部，常为碱性氨基酸加脯氨酸链两部分构成。
如SV40 T 抗原：pro-lys-lys-lys-Arg-lys(127-132)

 

第四章     原癌基因与抑癌基因

第一节  概述

  病毒致癌作用，病毒癌基因Viral oncogene，V-onc).。
  细咆癌基因(cellular oncogene ，c-onc)或原癌基因(protoncogene)
—正常细胞中与v-onc同源的基因，
  抑癌基因(tumor suppressor gene)：是指由于其存在和表达而抑制细胞癌变的基因。
原癌基因与抑癌基因生物学性质差异：
1．功能：抑癌基因在细胞生长中起负调节作用，抑制增殖、促进分化成熟与衰老，或引导多余细胞进入程序性细胞死亡(PCD)，原癌基因的作用则相反．
2．遗传方式：原癌基因是显性的，激活后即参与促进细胞增殖和癌变过程，而抑癌基因为隐性，只有发生纯合失活时才失去抑癌功能．
3．突变的细胞类型：抑癌基因突变不仅可发生在体细胞中，也可发生在生殖系(germ 1ine)细胞中，并通过其遗传突变，而原癌基因只在体细胞中产生突变。

第二节        原癌基因

      原癌基因是细胞的正常基因，其表达产物对细胞的生理功能极其重要，只有当原癌基因发生结构改变或过度表达时，才有可能导致细胞癌变。
一、原癌基因表达的特点：
l、正常细胞中原癌基因的表达水平一般较低，而且是受生长调节的，其表达主要有三个特点：①具有分化阶段特异性；②细胞类型特异性； ③细胞周期特异性。
2、肿瘤细胞中原癌基因的表达有2个比较普遍和突出的特点：
①一些原癌基因具有高水平的表达成过度表达·
②原癌基因的表达程度和次序发生紊乱，不再具有细胞周期特异性。
3、细胞分化与原癌基因表达    ．
在分化过程中，与分化有关的原癌基因表达增加，而与细胞增殖有关的原癌基因表达受抑制。
二，原癌基因的结构改变与其表达激活
(一)点突变
C--ras：12、13、61位密码子点突变，存在于多种肿瘤．
C-ras编码蛋白(21kD,P21)：RAS，是一种GTP结合蛋白，具GTP酶活性，是重要的信号转导分子．
(二)染色体易位
染色体易位(translocation)：是染色体的一部分因断裂脱离，并与其它染色体联结的重排过程。
  因染色体易位造成的原癌基因激活：
1、因易位使原癌基因与另一基因形成融合基因，产生一个具有致癌活性的融合蛋白，
如t(9：22)使c-abl与bcr融合，产生一个致癌的P210蛋白
2、因易位面使原癌基因表达失控，如t(8：14)易位使c-myc表达失控．
(三)基因扩增
基因扩增(gene amplification)即基因拷贝数增加．
如HL-60和其它白血病细胞，C-myc扩增8-22倍．其它：c-erb B，c-net．
(四)LTR插入
LTR是逆转录病毒基因组两端的长末端重复(long terminal repeat)，其中含有强启动子序列。
三、原癌基因产物的功能
大多数原癌基因编码的蛋白质都是复杂的细胞信号转导网络中的成份，在信号转导途径中有着重要的作用．
原癌基因产物可作为：
1、生长因子，如sis(PDGF-β)，fgf家族(int-2，csf-1等)
2、生长因子受体(质膜)：具酪氨酸蛋白激酶活性，如neu，ht，met，erbB，trk，fms，ros-1等。   
3、非受体酪氨酸蛋白激酶(质膜／胞质)
如src家族：src，syn，fyn，abl，lck，ros，yes，fes，ret等．
4、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶(胞质)：如raf，raf-1，mos，pim-1，
5、G蛋白(质膜内侧)，具GTP结合作用和GTP酶活性，如ras家族中的 H-ras，K-ras，N-ras，以及mel和ral等．    ，
6．核内DNA结合蛋白(转录因子)
如myc家族，fos家族，Jun家族，ets家族，rel，erb A(类固醇激素受体)

第三节  抑癌基因

一、抑癌基因失活与杂合性丢失
    抑癌基因为隐性癌基因，只有发生纯合失活时才对肿瘤形成起作用，通常的表现为抑癌基因的一个等位基因丢失，面另一个存留的等位基因发生突变(点突变、微缺失，重排等)，等位基因丢失常伴有抑癌基因相邻区域的杂合性丢失(Loss of heterozygosity，LOH)，
    LOS指肿瘤中特定染色体上某种DNA多态性标志(如RFLP，VNTR、STR或SSCP等)的等位基因片段在同一患者中由正常组织基因组中的两种变为一种，即等位基因型由杂合子变为纯合子。
    LOH是肿瘤细胞中部分染色体区域缺失的表现。
二、抑癌基因产物的功能

抑癌基因p53
人P53基因定位：17P13，11个外显子编码393个氨基酸。
p53基因突变：存在于一半以上的人肿瘤中，多为点突变，主要发生于外显子5-8,如肝癌中的249号密码子第3碱基G→T ,与黄曲霉素B1有关。
P53蛋白结构和功能：
P53蛋白为核内转录因子,包括①核心区的DNA结合域；②N端转录激活域；③C端介导寡聚体化的结构域。
1、P53的中央域识别和结合一个10bp的启动子序列，可激活转录（通过N-端的反式激活域）。P53突变大多发生于中央DNA结合域。
2、P53也可结合DNA损伤时产生的单链区域。
3、P53是四聚体，寡聚化需要C-端域
4、P53激活cki p21, 后者抑制细胞周期于G1期.
5、p53 激活与负责辐身损伤的修复蛋白GADD45，维持基因组稳定性。
6、P53诱导凋亡的机制尚不清楚。
7、正常情况下p53以低水平存在，半衰期短。DNA损伤稳定P53并增加其转录活性
8、Mdm2使p53不稳定，易被降解，并能直接抑制其反式激活活性（Mdm2是癌基因）

 

第五章   信号转导

细胞外信号通过与细胞表面的受体相互作用转变为胞内信号并在细胞内传递的过程称为信号转导(signal transduction)
跨膜信号转导过程包括：
1，胞外信号被质膜上的特异性受体蛋白识别，受体被活化；
2，通过胞内信号转导物(蛋白激酶，第二信使等) 的相互作用传递信号；
3，信号导致效应物蛋白的活化，引发细胞应答（如激活核内转录因子，调节基因表达）。

第一节   胞内信使

  细胞内信使(intracellular messenger)是具有信息传递作用的一些小分子，也称为第二信使(second messengers)。
一、cAMP{环磷酸腺苷)    ，
  生成： 腺苷酸环化酶催化ATP生成cAMP;
 代谢： cAMP磷酸二酯酶水解cAMP产生5’-AMP
  功能：①激活蛋白激酶A   ②抑制蛋白磷酸酯酶

二、cGMP(环磷酸鸟苷)
   生成酶：鸟苷酸环化酶
   代谢酶：cGMP磷酸二酯酶
   功能：①激活蛋白激酶G ②调控细胞膜离子通道
三、三磷酸肌醇（inositol triphosphate,IP3）和甘油二酯（diacyglycerol, DAG）
    G-蛋白偶联受体激活磷脂酶Cβ生成IP3及DAG
功能： 1、IP3：开放胞内钙库，激活Ca2+途径．
       2、DAD：在Ca2+和磷脂酰丝氨酸存在下，激活蛋白激酶C，
四、钙离子
    细胞内钙离子主要贮存于胞内钙库(如肌细胞的肌浆网，SR)和线粒体中。
    细胞质膜两铡[Ca2+]跨膜梯度：细胞外液>>胞浆
    胞浆内[Ca2+]的调节一通过(质膜和钙库膜上的)钙离子通道(进入)和钙泵(出)，
    钙通道开放的条件：
  ①质膜或钙库膜去极化(可兴奋细胞)；

②IP3介导钙库膜上钙通道开放(任何细胞)．

钙泵激活．线粒体钙泵的作用．
Ca2+功能：与钙调蛋白(calmodulin, CaM)结合形成Ca2+·CaM复合物：
①激活腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶，②激活Ca2+·CaM依赖蛋白激酶
 钙通道阻断剂及其临床应用。
五、一氧化氮(NO)
NO合成酶催化L-精氨酸生成NO和胍氨酸