②内皮细胞型(ecNOS)
                          ③诱导型（iNOS)

功能：激活乌苷酸环化酶，刺激cGMP合成。
NO的生理病理作用

第二节 蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶

蛋白激酶(Protein kinase，PK)催化蛋白质的含羟基氨基酸(丝／苏和酪)的侧链羟基形成磷酸酯（ATP的γ磷酸基转移至氧）．
    蛋白质磷酸酯酶(Protein phosphatase，PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯键水解而去磷酸化。
    细胞内任何一种蛋白质的磷酸化状态是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的两种相反酶活性之间的平衡决定的。
    蛋白质可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。
一、信号转导过程中的蛋白激酶
{一)丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶(Ser／Thr  PK)
    是一大类特异地催化蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化的激酶家族，参与多种信号转导过程。
1、蛋白激酶A（PKA)
  -cAMP依赖性蛋白激酶.
  PKA由两个催化亚基C和两个调节亚基R所构成
  PKA参与cAMP介导的转录水平调控。
  PKA的其它(下游)底物：①多种代谢相关酶②核内组蛋白和非组蛋白③膜蛋白等。
2、蛋白激酶C(PKC)
  -Ca2+激活的／磷脂依赖性蛋白激酶．
   调节：可被Ca2+，DAG和磷脂酰丝氨酸激活．TPA(佛波酯)也可激活．
   PKC分子由N-端的调节区和C—端催化区（亲水的蛋白激酶结构域）所组成。
PKC有多种亚型(>12种)．
PKC可激活：
①受体，如EGFR，胰岛素受体，细胞因子受体等。
②细胞骨架蛋白如Map，Tau．
②膜蛋白，如Na+-H+交换蛋白，Ca2+-ATP酶等．
④核蛋白／转录因子，起始因子等，
⑤信号转导物如鸟苷酸环化酶，Raf-1等．
3、Ca2+·钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Cam-PK)
  Cam-PKII是一种多功能的蛋白激酶．
4。cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)
  功能：调节胞内钙离子．
5，DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)
  调节：结合游离DNA片段后被激活，
  底物：核内DNA结合蛋白和转录因子，如SPl，Fos／Jun，Myc和P53，
  作用：①参与DNA修复和重组,
         ②通过激活TF调节基因表达;
       ③参与细胞周期的关卡机制(Checkpoint).
6．丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase， MAPK)
    调节：MAPK激酶-MAPKK（MEK）。
    下游底物：核内转录因子如Myc，Jun，Ets及其它胞内蛋白．
(二)酪氨酸蛋白激酶（Tyrosine protein kinase，TPK)
    —特异地催化蛋白质的酪氨酸残基磷酸化，
    蛋白质酪氨酸磷酸化在细胞生长，分化和转化的调节中起重要作用。
  1、经典的src激酶家族
    原癌基因c-src蛋白产物Src是一种酪氨酸蛋白激酶，它有三个基本结构域：从C-端至N--端依次为SH1、SH2，SH3(SH=src homolog)。
    SHl结构域：具酪氨酸激酶活性，
    SH2结构域：能识别并结合含磷酸化酪氨酸的短序列，
    SH结构域：通过脯氨酸和疏水性氨基酸残基与靶蛋白结合，
    Src家族：包括原癌基因src，yes，lyn，fyn，lck，blk，fgr，bcd和yrk编码蛋白，它们都有TPK活性．共同参与细胞转化的信号转导过程．
    SH2结构域在信号转导途径中的重要作用：由于含SH2结构域的信号转导分子可以识别和结合其他含磷酸化酪氨酸的蛋白，因此，通过蛋白质的酪氨酸磷酸化／去磷酸化调节可以决定信号转导分子的结合与解离，从而导致信号的开启或关闭。
  2、JAK嫩酶家族
    JAK(Janus  kinase)激酶家族包括Jakl，Jak2，Jak3，Tyk2等，
    Jak激酶具有一个TPK结构域和一个激酶样结构域，它们与Src的TPk激酶结构域具有同源性，但JaK激酶没有SH2，SH3结构域；
    Jak激酶主要参与细胞因子的信号转导．
二、蛋白磷酸酯酶对磷酸化的调节
(一)、丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶   
    这类酶选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性．
    主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C，等．
    PP2A，催化亚基及其功能．   
(二)酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)
    蛋白质酪氨酸磷酸酯酶催化磷酸化酪氨酸残基的去磷酸化反应，与相应的酪氨酸蛋白激酶共同调节蛋白质的磷酸化水平，
    PTPase家族可分为2类：
  1、胞质型(非受体型)：小的可溶性蛋白，只有一个催化结构域，
    特点是合有SH2 domain，如PTPlC，，PTPlB等．    ，
  2．受体型(PTPR)，是大的跨膜蛋白，特点是有2个串联的胞浆催化结构域，如白细胞共同抗原CD45，
    PTPlC(存在于造血细胞)：N端2个串联重复的SH2结构域{识别Tyr·P，并指导蛋白与蛋白结合)，C端为磷酸酯酶催化结构域。
    Jak可作为PTP1C底物．
    PTPase基因可能是肿瘤抑制基因．

第三节   细胞膜受体介导的信号转导

一、受体的分类
   质膜受体和胞内受体（胞浆或核受体，如类固醇激素受体）
   膜受体的分类：
（一）G蛋白耦联受体家族
又称为七次胯膜受体家族，特点是具有七段跨膜的α螺旋结构，本身无酶活性，胞浆侧肽链上有磷酸化位点，受体功能受磷酸化调节。成员；肾上腺素受体、多巴受体、视紫红蛋白等。
（二）酪氨酸激酶受体家族
   受体本身胞浆侧有蛋白酪氨酸激酶活性，并且胞浆侧肽链上有自身磷酸化位点，配基结合后受体形成二聚体，二聚体中每个亚基可以磷酸化对应的另一亚基，从而启动信号转导。
    这类受体主要包括多数生长因子受体(如IGF，EGF，PDGF，NGF，SCF，HGF等生长因子的受体)，除胰岛素受体外，这类受体均由一条肽链组成．
(三)细胞因子受体家族
   这类受体本身无TPK活性，但其胞浆侧近膜部分有非受体酪氨酸蛋白激酶的结合位点，在配基与受体结合后，受体发生二聚化或寡聚化，并激活Jak族蛋白酪氨酸激酶．
    此类受体包括细胞因子受体以及生长激素、促乳素等受体．
    细胞因子(cytokine)：是淋巴细胞和造血细胞产生的一大类对细胞生长和分化有调节作用的蛋白因子。包括干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、白血病抑制因子（LIF）、抑癌素M等  (但IL-8R为G蛋白藕联受体)
(四)离子通道受体
    与配基结合后构成离子通道，主要存在于神经突触，如乙酰胆碱(ACH)，5-HT受体等。
二、G蛋白介导的信号转导    。
  G蛋白藕联受体的信号转导途径由三部分组成：
    ①细胞膜受体；②G蛋白③效应物(effector)，其中G蛋白将受体与效应物藕联．
    G-蛋白(G-protein)是一种鸟苷酸结合蛋白，是由α、β和γ三个亚基组成的异三聚体，  多，β和γ亚基总是紧密结合在一起作为一个功能单位Gβγ
    Gα亚基可分为Gs,Go,Gi,Gq等，其活性可被霍乱毒素（CT）或百日咳毒素（PT）修饰。
    G-蛋白介导的信号转导的机制：G-蛋白循环。
        G-pr的效应物：离子通道、腺苷酸环化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2等
三、RAS-MAPK信号转导途径
1、途径中的信号分子
Ras：具鸟苷酸结合活性的一种胞浆蛋白（与G-蛋白不同)
    Ras活性与其结合的鸟苷酸有关。
    接头蛋白：生长因子受体结合蛋白Grb2，通过其SH2结构域与Tyr被磷酸化的受体结合，同时通过其

SH3域与具有pro富集区的SOS结合，并通过SOS活化Ras蛋白．
2、Ras-MAPK途径：
    生长因子→生长因子受体(具酪氨酸激酶活性)→含有SH2结构域的接头蛋白(如Grb2)→鸟苷酸交换因子SOS→Ras-GTP→Rafl→MAPKK（MEK）→MAPK→转录因子→调节基因表达。
3．Ras-MAPK途径的调节
①Ras-MAPK途径中信号转导分子的突变(如Ras)和表达量的改变．
②其他信号转导途径的影响
    cAMP-PKA：抑制Raf-1；    PKC：活化Raf~l，
四、Jak-stat途径：
STAT：信号转导物与转录激活剂（signal transducer and activators of transcription）
至少6种，分子量84-113KD，含一个SH2结构域(羧端)，一个SH3样结构域，并合有DNA结合域，Stat的激活依赖通过磷酸化形成二聚体．
 Jak-Stat途径：
细胞因子→受体(二聚体化)→Jak→Stat→Stat二聚体(活化)→易位至核，影响转录．

 

第六章   细胞周期及其调节

细胞增殖(cell proliferation)与细胞生长分裂周期．
   第一节  细胞周期

一、细胞周期(cell cycle)：指亲代细胞分裂结束到子代细胞分裂结束所经历的过程，这个过程所需的时间称为细胞周期时间。

    细胞周期由G1、S、G2和M期组成(G1、S和G2期又合称为分裂间期)。
    G1(Gap1)期：DNA合成前期(复制前期)，从上次有丝分裂完成到DNA复制之前的阶段;
    S期：DNA复制期;
    G2期：合成后期，从DNA复制完成至有丝分裂开始;
    M期：有丝分裂(Mitosis)期，包括核分裂和胞质分裂．
    M期结束后形成两个新的子细胞。
注：①不同细胞的细胞周期时间不同，一般S+G2+M期较恒定，而G1期变化较大，因而它决定了细胞周期时间的长短；
  ②G1期细胞有三种可能的趋向：1)进入S期(即进入细胞周期)．2)处于静止期即Co期(在一定条件下可重新进入增殖周期)，3)分化、衰老、凋亡。

二、细胞周期中各时相的主要生化事件
    细胞周期中每期都有其特殊功能，其中S期的DNA复制和M期细胞核的有丝分裂是细胞周期中2个最关键的过程：
  1、G1期：为DNA复制作准备，G1早期合成各种RNA、结构蛋白和酶等，细胞通过一个限制点(restriction point，R点)后在G1后期合成DNA复制有关的蛋白和酶。
   在开始合成DNA之前有一个关卡(checkpoint)，检查染色体DNA是否有损伤，如有则先要进行修复。
  2、S期：DNA(包栝端粒)的复制及组蛋白合成、核小体装配．S期后每一染色体复制成2个染色单体·  
     S→G2期关卡：检查DNA复制是否完成
  3、G2期：为有丝分裂作准备．有RNA和非组蛋白合成。
  4、M期：染色体浓缩一仿锤体形成→染色体分离并移向细胞两端→染色体解聚，形成两个新核→胞质分裂。

第二节   周期素依赖性蛋白激晦与细胞周期调节

周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs) 通过使特异底物磷酸化调节细胞周期进行，其活性依赖与周期素(cyclin)结合形成复合物。
一、周期素-周期素依赖性蛋白激酶
    周期素家族和周期素依赖蛋白激酶(CDK)家族．
    细胞周期的不同时相表达不同cyc-CDK，这些cyc-CDK复合物在各不同的细胞周期过渡点起作用．
1、G1期cyc-CDK
    G1期表达的周期素为周期素C、D（D1、D2、D3)和E。
    D族周期素主要与CDK4(以及CDK2、CDK5、CDK6)结合成活性的蛋白激酶复合物，对细胞通过R点(G0→G1过渡有重要作用。
    E族周期素与CDK2形成复合物。
    cycE-CDK2复合物调控G1→S过渡。
2、S期和M朔cyc-CDKs
    cycA-CDK2：驱动细胞通过S期．
    cycB-cdc2：驱动G2→M期过渡(cdc2或p34cdc2即CDKl)．
二、周期素依赖性蛋白激酶抑制物
    (cyclin-dependent kinase inhibitor，CKIs)
    CKls通过与CDKs结合而抑制激酶活性，在细胞周期中起负调控作用．
    CKIs一般按其分子量命名．  ：
    CKls的分类：
1,Kip／Cip家族：包括三种结构相关蛋白P21,P27,P57,特点是能结合并抑制大多数cyc-CDK复合物；
    P21(其它名称WAFI／CIPl等)：可被P53诱导转录，P21抑制cycDl-CDK4和cycE-CDK2，参与(由于DNA损伤诱导的)P53介导的细胞周期停止。
    P27参与血清去除、接触抑制和TGF-β等导致的细胞周期停止。
2、 INK4蛋白家族，包括四种相关蛋P16、P15、P18、P19．
    特点：INK4是cycD-CDK4和cycD-CDK6的专一性抑制剂，并与CDK单体结合。
    P15可能参与TGF-β诱导的细胞周期停止于G1期，    ’
三、细胞周期调节因子与肿瘤
1、cyclin和CDKs可能为原癌基因，其突变或过度表达可导致细胞转化。
2、CKI可能是广谱的肿瘤抑制基因，其失活导致CDK活性失调。
p16(MTSl)在肿瘤中突变特点及其作用。

第三节  细胞周期的其它调节机制

生长因子、生长抑制因子、原癌基因(如，myc)和抑癌基因产物、蛋白质可逆磷酸化、蛋白水解等对细胞周期也有重要调节作用。
一、pRB    ，    ·
抑癌蛋白，分子量106KD，其活性与磷峻化状态有关：
G0及G1早期：pRB非磷酸化，与转录因子E2F-1结合(抑制转录)
GF等→cycD-CDK4及cycE-CDK2激活→pRb磷酸化(失活)→释放E2F→DNA合成基因表达。
二、p53
抑癌蛋白(转录因子)，
在细胞周期中的作用：参与细胞周期关卡-DNA损伤检查的关键蛋白(通过诱导P21转录使细胞周期停止于G1期)。
三、细胞因子对细胞周期的作用．
1．生长因子在细胞通郧点中的作用
GF→GFR→Ras-MAPK→fos/jun等基因表达→cycD-CDK4等表达→pRB磷酸化→E2F释放→进入细胞增殖周期。
2、生长抑制因子与细胞周期停止
TGF-β使细胞周期停止于G1期。
四、泛有素(Ubiquitin，Ub)介导的蛋白水解作用
周期素，周期素依赖性蛋白激酶抑制剂(如P27)以及其它细胞周期调节蛋白均可通过泛有素介导的蛋白酶水解作用降解，这些按精确的时间顺序进行的蛋白水解反应在细胞周期的不同阶段起着重要的调节作用。

 

第七章  细胞凋亡

凋亡（apoptosis）, 程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）生理性细胞死亡。

第一节        细胞凋亡概论

一、凋亡与坏死apoptosis vs. necrosis）
凋亡是一个受细胞主动调节的自身消化过程，凋亡细胞的特征形态学改变使其可被其它细胞吞噬而不泄露胞质内容物，不会引起炎症反应。
坏死是由于物理损伤、缺血或细菌毒素等引起的破坏性细胞死亡过程，细胞内容物的释放导致局部炎症反应。
二、凋亡的生理功能
1维持组织稳态平衡（homeostasis）,通过干细胞分裂产生新细胞的同时，选择性地除去那些损伤的或老的或多余的细胞。
2清除不需要的免疫细胞。
3神经元发育
4个体发育
三、凋亡细胞的形态学和生化特征
1细胞皱缩（shrinkage）
2质膜出泡（blebbing）
3染色质浓缩
4 DNA裂解：核小体DNA ladder
5 磷脂酰丝氨酸由质膜内侧翻转至外侧
6凋亡小体的释放

第二节  凋亡的分子机制

一、细胞表面死亡受体
        细胞死亡受体家族的成员是一类跨膜蛋白，它们均含有一个与配基结合的胞外结构域；一个跨膜域和一个转导胞外信号进入胞内的胞内结构域(死亡结构域)。这此受体（如Fas、TNF受体）同它们的配基结合后被激活并导致细胞凋亡。
二、Bcl-2家族
   对B细胞淋巴瘤的研究发现bcl-2是一种抗凋亡基因，进一步研究证明它与ced-9基因同源。
 1.由于8：14染色体易位所致的bcl-2过度表达抑制肿瘤细胞凋亡。
 2.与Bcl-2功能相似的有Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, and A1等，构成一个大的蛋白家族。
 3.这些蛋白表达于线粒体、内质网和核被膜的外膜，Bcl-2及其高度同源物Bcl-xl 保护线粒体膜的完整性。
Bax-促进凋亡的Bcl-2家族成员：
 1.与Bcl-2结合的蛋白，包括Bax、Bak、Bik 、Bid、 Bim和HRK。
 2.当在细胞中过度表达时促进凋亡，其杀细胞活性可被Bcl-2类蛋白拮抗。
 3.抗凋亡蛋白和促进凋亡的蛋白如Bcl-2和Bax间的比率决定细胞对凋亡信号的敏感性。
 4.Bax可被 P53上调，这是DNA损伤时P53诱导细胞死亡的一种方式。
 5.这些蛋白通常存在于其它胞内隔室如胞浆中，在凋亡时移动进入线粒体。
三、Caspase 蛋白酶-实施凋亡的蛋白酶
1.这是一族半胱氨酸（cysteine）催化的在天冬氨酸（aspartic acid）处裂解底物的蛋白酶（半胱天冬酶）
2.所有Caspase先以无活性的酶原（procaspase）的形式合成，其激活过程包括：①二聚体化②caspase自身序列裂解成小亚其和大亚基③除去prodomain。
3.最早发现的 caspase 为IL-1β转化酶 (ICE=caspase-1) 它将 pro-IL-1  前体裂解成其活性形式。 ICE 基因转染导致细胞凋亡。此过程可被一种牛痘病毒蛋白CrmA抑制。 CrmA抑制所有caspase。
4、已知该家族成员超过12个，虽然其中某些 caspase参与白细胞介素的成熟，但大多数作用是激活凋亡 。通过在特异性caspase裂解位点(e.g. DEV D)处裂解靶蛋白，而使蛋白激活或失活，从而影响凋亡。
例如：
a. DFF -DNA fragmentation factor- cleavage of an inhibitory subunit activates this nuclease which cuts the DNA into a distinct ladder-likepattern and for chromatin to condense.
b. PARP -Poly-ADP ribose polymerase, a DNA repair enzyme inactivated by caspases
c. nuclear lamin - causes nucleus to lose its structural integrity after cleavage
d. cytoskeletal proteins - cleavage causes membrane blebbing

5.杀伤T-淋巴细胞可释放颗粒酶(granzymes)于靶细胞上而诱导凋亡:granzymes裂解和激活caspase→诱导凋亡
6、现正研究能完全阻断凋亡的caspases抑制剂， 看它们是否能保护中风、心梗和器官移植中细胞免于因缺血诱导的凋亡
四、 Caspases的激活
（一）死亡受体被其配基激活
 1.TNF 受体与称为TRADD的蛋白结合，后者再结合 FADD； Fas直接与 FADD结合。
 2. FADD结合caspase-8 (又称为 FLICE),它含有死亡结构域同时又具蛋白酶催化活性
 3.活化的caspase-8激活凋亡途径.；
 4..触发激活的关键是受体的寡聚化。在 Fas系统中 FasL与 Fas 的相互作用导致 Fas 受体形成三聚体,从而激活凋亡。
 5、FasL 也是一个单一跨膜蛋白。FasL 既可通过与之相互作用杀死相邻细胞，也可激活细胞自身的Fas而自杀。

（二）Apaf1- caspase活化蛋白
1.Caspase-8裂解 Bid 使其 C-端域易位至线粒体中。
2.Bid及其它 Bcl2家族促凋亡蛋白的作用导致线粒体释放细胞色素C。.
3.Bcl2抑制cytochrome c释放。
4.Cytochrome c 在胞浆中与Apaf-1结合。Apaf-1/cytochrome c经需能的寡聚化形成大的蛋白复合物 (Apoptosome)，后者聚集procaspase-9
5. procaspase-9经自身裂解而活化。
6.Caspase-9裂解caspase-3和其它caspases，激活凋亡的效应器期 effector phase ）,从而使细胞结构被破坏。

五、IAPs, 抑制caspase 活性的蛋白家族
A. IAPs are inhibitors of apoptosis protein. There are 7 identified IAPs in human.
B. IAPs inhibit apoptosis by inhibiting caspase activities.
C. IAPs provide a safeguard mechanism against minimal activation of the apoptosis program.
D. Several IAPs are overexpressed in tumors.

第三节 凋亡与疾病

A. Cancer
B. Autoimmune disease
C. Neurodegenerative disease
1. ALS - Amyotrophoic lateral sclerosis or Lou Gehrig’s disease
2. Spinal muscular atrophy

 

第八章   基因克隆