一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：
１.获得待克隆的DNA片段（基因）；
２.目的基因与载体在体外连接；
３.重组DNA分子导入宿主细胞；
４.筛选、鉴定阳性重组子；
５.重组子的扩增与／或表达。

第一节        重组DNA中常用的工具酶

包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶等，
一、限制性内切酶的定义、命名和分类
      限制性核酸内切酶是识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
      限制性核酸内切酶的来源：细菌的限制－修饰系统。
 分子克隆中所用的限制性核酸内切酶属于第Ⅱ类。
      限制性核酸内切酶的命名。
二、限制性核酸内切酶的作用特点
1.识别位点的DNA序列呈二重旋转对称（即具有迥文结构）；
2.切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端；
3.错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端；而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端，也称钝性末端。
4.少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点，这些酶称为同切酶，如MboI Ⅰ和 Sau3A。
三、其它工具酶
参考“分子克隆”（Sambrook,J et al . molecular cloning）

第二节   载体－宿主系统

一、概述
        载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。
载体应具备以下条件：
 １.能在适当的宿主细胞中复制；
 ２.具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源DNA插入；
 ３.具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；
 ４. 载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体DNA与宿主DNA便于分离；
 ５. 对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。
 宿主细胞是基因克隆中重组DNA分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：
 １.对载体的复制和扩增没有严格的限制；
 ２.不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；
 ３.在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；
 ４. 重组缺陷型，不会产生体内重组；
 ５.容易导入重组DNA分子；
 ６. 符合重组DNA操作的安全标准。
二、质粒载体
 质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗 传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。
作为载体的质粒一般具有以下特点：
   １.分子相对较小（３∽１０kb）；
   ２.松驰型复制；
   ３.具有适当的多克隆位点以便外源DNA插入；
   ４.具有插入失活筛选标志，便于从平板上直接筛选阳性重组子；
   ５.质粒能携带的外源DNA片段一般较小（<15kb）．
三、λ噬菌体载体
   λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约为50kb+。
线性λ噬菌体DNA分子的两端各有12碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS位点。
 λ噬菌体的生活周期：溶菌（裂解）生长时在平皿上形成清亮的噬菌斑；溶源性生长。
 λ噬菌体的基因组：左臂长约20kb,含噬菌体头、尾蛋白编码基因；中央片段长约12-24kb,对噬菌体为非必需区；右臂长约10kb,含λ噬菌体复制和溶菌相关蛋白的编码基因。所有λ噬菌体载体均为通过切除非必需的中央区，并增减某些限制性酶切位点和插入适当的筛选标记基因改造而成。
已构建的λ噬菌体载体分为两类：
   １.置换型载体：有两个酶切位点或两组排列相反的多克隆位点，其间的DNA片段可被外源DNA置换。这类载体适于克隆5-20kb的外源基因片段，常用于构建基因组DNA文库。
   ２.插入型载体：只有一个限制性内切酶位点或一组多克隆位点可供外源基因插入。这类载体允许插入5-7kb的外源DNA,适于构建cDNA文库。如λgt 噬菌体载体。
一般将噬菌体DNA在体外包装成病毒颗粒后再用于感染受体菌，这样能大大提高转染效率。
四、Ｍ13丝状噬菌体载体
    Ｍ13基因组大小为6407bp，它是一种闭环的单链DNA分子，在感染细菌后呈双链复制型DNA。因此用作克隆载体的双链DNA可从细菌中分离得到。在细菌中，双链DNA复制100-200拷贝后就大量产生单链DNA,后者包装成子代噬菌体颗粒，分泌到细胞外，而不裂解细菌。
在M13基因组中含507个核苷酸的非必需区，在这个区域插入外源DNA不会影响M13的繁殖和生存，现在使用的M13载体如M13Mp18等均为对此区域进行改造而获得。
M13克隆的最大问题是不能插入较大的外源ＤＮＡ片段（一般<1000bp）,但M13载体的优点是从细菌中释放出来的噬菌体颗粒中含有一条与克隆的模板DNA互补的单链，所以最适合于制备DNA测序时用的单链模板，另外也可用于制备单链特异性DNA探针。
五、粘粒载体
        粘粒（柯斯质粒）是指含有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNA的COS区(约20-数百bp)与质粒重组而成，在宿主细胞中可作为正常噬菌体进行复制，但不表达任何噬菌体的功能。
粘粒的结构特点：
     １.含有抗药性标记和质粒复制起始位点；
     ２.一个或多个单一限制酶切位点；
     ３.带有λ噬菌体粘性末端；
     ４.分子小（4-6kb）,可容纳大到40-50kb的外源DNA片段，因此适于构建真核生物基因组DNA文库。
六、酵母人工染色体载体
   酵母人工染色体由酵母染色体的着丝粒(cen4)、自主复制序列(ARS1)和来自四膜虫的端粒(Tel)等功能性DNA序列组成。它可携带长达200-1000kb的DNA片段，因此在人基因组DNA大片段的克隆中非常有用，是染色体克隆排序的主要工具。
用酵母人工染色体克隆DNA的过程与λ噬菌体相似，将DNA大片段与载体的两臂相联，然后将连接混合物转化进酵母细胞中，利用载体上的选择性标记进行筛选。

第三节 目的基因的获取

一、通过建立基因文库分离靶基因
        基因文库包括两类：基因组文库和cDNA文库，两种文库的建库过程不同，产生的基因结构也不同，因此应用范围也不相同。
（一）、基因组文库
        是含有某种生物体（或组织、细胞）全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。
        用λ噬菌体载体构建基因组文库的基本步骤：
１.准备载体DNA(如置换型λ噬菌体载体)，用适当的限制酶消化并分离得到载体的左右两臂；
２. 纯化真核细胞高分子量DNA，并用适当的限制酶部分消化；
３.分离适当大小的基因组DNA片段（20-24kb）；
４. 连接载体与外源ＤＮＡ；
５.连接产物体外包装及感染；
６.基因组文库的扩增。
由于基因组文库包含了染色体的所有随机片段形成的重组DNA克隆，因此，利用适当的筛选方法，就可以从中找出携带所需目的基因片段的重组克隆。
（二）、cDNA文库
        cDNA是指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA.
以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体称为cDNA文库。
从cDNA文库可以获得较完整的连续编码序列（不含内含子），便于表达成蛋白质。
构建cDNA文库的主要步骤：
   １.mRNA分离；
   ２.cDNA第一链合成；
   ３.cDNA第二链合成；
   ４.载体与cDNA的连接;
   ５.噬菌体的包装及转染；
   ６.cDNA文库的扩增和保存。
二、化学合成法制备DNA片段
      主要用于一些小的DNA 片段的合成。
三、聚合酶链反应法扩增基因片段
     对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基因片段。

第四节        DNA分子的体外连接

DNA片段的体外连接是重组DNA技术的关键。DNA连接是由DNA连接酶催化完成的。
一、DNA连接酶
        DNA连接酶催化两年双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。
 T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：
   １.连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；
   ２.连接双链DNA分子间的平端；
   ３.在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。
二、粘性末端连接
          如果载体和插入片段具有相同的粘性末端，则很容易用DNA连接酶连接成环状的重组DNA分子，但是要注意当载体和插入的两个末端均为同源的粘性末端时，连接后可能出现以下问题：
１.载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA 5’- 端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；
２.插入片段可双向插入；
３.插入片段可多拷贝插入。
 当DNA片段两端为非同源的粘性末端时，可实现定向克隆，这时的连接效率非常高，是重组方案中最有效、简捷的途径。
三、平端连接
        平端连接的优点是可用T4连接酶连接任何DNA平端，这对不同DNA分子的连接十分有利。因为除了相同或不同限制酶酶切产生的平末端分子外，含3’-或5’-突出的粘性末端也可以被补齐或削平，实现平端连接。
（一）、5’-突出粘性末端的补齐
        限制酶降解产生的5’-端突出的粘性末端，可用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段（klenow片段）补齐。
（二）、3’-突出粘性末端的削平
        含3’- 突出的粘性末端可用T4 DNA聚合酶的3’→5’外切核酸酶活性补平。
        平端连接的主要问题是，它的连接效率比粘性末端低，因此需较多的T4 DNA连接酶和较高的底物浓度，聚乙二醇（ＰＥＧ）可促进平端连接反应。
四、人工接头连接
        对平端DNA片段，可借助人工合成的接头来方便连接。所谓接头是人工合成的至少８个核苷酸长的一段迥文序列。接头是平端，在磷酸化后通过T4 DNA连接酶可与大多数平端DNA连接。连接后用相应的限制性内切酶切割，可产生所需要的粘性末端。
五、利用适配子连接
        适配子是人工合成的具有一个以上限制酶识别位点的短序列，它具有一个平端，可与其它DNA的平端连接，同时它还有某种限制酶的突出端，可与含互补的限制酶突出端的DNA片段连接，连接后，用适当的限制酶切割又可产生所需要的突出粘端。

第五节        重组DNA导入宿主菌

体外连接的重组DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制、增殖和表达。根据所采用的载体的性质，将重组DNA分子导入受体可有不同的方法。
一、转化   
     指以细菌质粒为载体，将外源基因导入受体细胞的过程。转化时，细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源DNA的状态，然后利用短暂热休克使DNA导入细菌宿主中。
此外还可用电穿孔法转化细菌，它的优点是操作简便、转化效率高、适用于任何菌株。
二、转染和感染
     利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。

第六节        重组克隆的筛选与鉴定

基因克隆的最后一步是从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组子的菌落，并鉴定重组子的正确性。通过细菌培养以及重组子的扩增，获得所需的基因片段的大量拷贝。进一步研究该基因的结构、功能，或表达该基因的产物。
一、抗药性标志的筛选
        如果克隆载体带有某种抗药性标志基因如ampr或tetrr ，转化后只有含这种抗药基因的转化子细菌才能在含该抗菌素的平板上幸存并形成菌落，这样就可将转化菌与非转化菌区别开来。如果重组DNA时将外源基因插入标志基因内，该标志基因失活，通过有无抗菌素培养基对比培养，还可区分单纯载体或重组载体（含外源基因）的转化菌落。
二、β－半乳糖苷酶系统筛选
        很多载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，载体转化的宿主细胞为lacZΔ15基因型，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 变为兰色化合物，这就是所谓的α－互补，而重组子由于基因插入使α－肽基因失活，不能形成α－互补，在含X-gal的平板上，含阳性重组子的细菌为无色菌落或噬菌斑。
三、菌落快速裂解鉴定法
        从平板上直接挑选菌落裂解后，直接电泳检测载体质粒大小，判断有无插入片段存在，该法适于插入片段较大的重组子初筛。
四、内切酶图谱鉴定
        经初筛鉴定有重组子的菌落，小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA,用相应的内切酶切割，释放出插入片断；对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入的方向。
五、通过聚合酶链反应筛选重组子
        一些载体的外源DNA插入位点两侧存在特定的序列，如启动子序列等，利用这些特异性序列作为引物，对小量制备的质粒DNA进行聚合酶链反应（PCR）分析，不但可迅速扩增插入片断，判断是否阳性重组子，还可直接对插入进行DNA 序列分析。
六、菌落或噬菌斑原位杂交
        它是先将转化菌落或噬菌斑直接铺在硝酸纤维素膜或琼脂平板上，再转移至另一膜上，然后用标记的特异DNA探针进行分子杂交，挑选阳性菌落。该法能进行大规模操作，一次可筛选多达5x105-5x106个菌落或噬菌斑，特别适于从基因文库中挑选目的基因。

 

第九章  基因诊断

基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。
基因诊断的主要技术：
1、核酸分子杂交
2、聚合酶链反应（PCR）
3、基因芯片技术

第一节        核酸分子杂交技术

核酸杂交（Nucleic acid hybridization）是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下，按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。
一、核酸杂交的基本原理
 DNA的变性和复性：
     在一定的条件（如适当的温度、有机溶剂存在等）下，DNA的双链可解开成为单链，这一过程称为DNA的变性（Denaturatioin）。高温、低盐和有机溶剂促进DNA变性。
    Tm值是反映DNA的热稳定性的一个参数，称为DNA的熔化温度，系指一半的双链DNA解离成为单链时的温度。
    DNA的热稳定性或Tm值直接与其碱基组成特别是GC碱基对含量有关，GC碱基对含量越高，Tm值也越高。
    DNA的杂交即复性（Renaturation）是变性的单链DNA在一定的条件下（低于Tm的温度下）与其互补序列退火形成双链的过程，因此杂交与Tm值相关。
影响杂交的主要因素：
    温度：一般在低于Tm约15至２５度的温度下杂交速率最快。
    盐浓度：钠离子增加杂交分子的稳定性，降低钠离子浓度强烈地影响Tm值和复性速率。但当钠离子浓度超过0.4M时，对复性速度和Tm值影响不大。
    甲酰胺：有机溶剂如甲酰胺能减少双链核酸的稳定性。每增加1%的甲酰胺，DNA/DNA或DNA/RNA双链的Tm值减少0.72℃。常用50%甲酰胺
    硫酸葡聚糖：使杂交速率增加，但有时可能增加杂交本底。
二、核酸探针的选择和标记
    核酸探针是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知核酸片段，它必须具有高度的特异性，并且带有某种适当的标记以便被检测。
 （一）核酸探针的类型
      1、克隆的DNA片段，常用cDNA探针。
      2、RNA探针（Riboprobe）
      RNA探针的优点是特异性高；杂交效率(灵敏度)更高。适合于Northen杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定，易被降解，另外其制备较困难。
3、寡核苷酸探针 可用化学方法人工合成，制备较方便，但灵敏度稍差。
4、聚合酶链反应扩增产物 是很好的探针来源，其优点是制备和标记相对容易。
（二）核酸标记的类型
     放射性同位素 目前应用最广，优点是灵敏度高，特别适用于单拷贝基因或低丰度mRNA检测，缺点是易造成放射性污染以及半衰期短，使用不便。
核酸探针标记常用的同位素有以下几种：
   １.３２P：其放射性强，自显影时间短，灵敏度较高，缺点是半衰期短（14.3天），放射线散射较严重，因此对分辩率有影响。
   ２.35S ：放射性较低，半衰期长（87.1天），灵敏度较高；低散射，因此在用Ｘ－光片自显影时分辩率高，特别适用于核酸序列分析和原位杂交等实验。
   ３.33P ：是一种较理想的同位素，它的放射性较低，灵敏度高，分辩率好，半衰期也较长(25.4天)，适用范围较广。但价格偏高。
   非同位素标记：常用地高辛或生物素系统。
   优点：无放射性污染，较稳定；缺点：灵敏度、特异性稍差。
（三）核酸探针的标记
   1、随机引物法（Random priming）
随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物，因此可以与任何核酸片段杂交，并作为聚合酶反应的引物。
标记酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段－klenow片段。
特点：所得探针的放射性比活较高，适用于大多数杂交。
   2、缺刻平移法(Nick translation0
     标记酶：大肠杆菌DNaseⅠ（极微量）和DNA聚合酶Ⅰ。
            用缺刻平移法制备的探针较短，较适合于原位杂交。
     3、RNA探针的制备和标记
        RNA探针可用RNA聚合酶体外转录法制备。该方法的合成效率高，所得产物大小均一，有较高的    比活，特异适合于Northern杂交和原位杂交。
     4、聚合酶链反应标记DNA探针
       利用Taq DNA聚合酶和标记的dNTP,sk 以少量的起始模板合成高比活的c双链或单链DNA探针。
     5、寡核苷酸探针的标记
        5’-端标记：T4多核苷酸激酶标记法，一般用于制备DNA序列分析时用的5’-标记的寡苷酸引物。
        3’-端标记：末端转移酶法，32P-dNTP或ddNTP。
      6、非同位素核酸探针标记：地高辛或生物素标记的核酸探针的制备方法和同位素探针相似。但是不能用多核苷酸激酶标记法直接对5’-端进行非同位素标记。

三、常用核酸杂交技术