微生物学笔记(武汉大学-沈萍版)

第七章
1939年，Max Delbruck & Emory Ellis对噬菌体（E. coli / bacteriopage）生长特征的测定：
1、用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞；2、数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）；
3、将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感染其它细胞；4、保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量进行计数）；5、以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线；
有尾噬菌体：注射方式将噬菌体核酸注入细胞
1）通过尾部刺突固着于细胞；2）尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，使细胞壁产生小孔；
3）尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入胞内，蛋白质外壳留在胞外；
λ噬菌体的的溶源性反应：
1）早期基因表达，产生gpcII，gpcro及gpcIII，后者可防止宿主的裂解酶对gpcII的降解。
2）gpcII的积累促使阻遏蛋白cI的表达
3）阻遏蛋白cI的积累导致噬菌体基因转录的终止，形成原噬菌体。
3）早期表达的gpcro与cI的竞争最终确定λ噬菌体是进入溶源状态，还是进入裂解循环。
4）（ gpcro表达得早，但与基因组的结合能力较cI弱）
5）阻遏蛋白cI的同样可以抑制其它新侵入的λ噬菌体的表达，从而使溶源性细菌具有“免疫性”
6）阻遏蛋白cI在一般情况下通过自身的转录激活保持低水平的表达，但有时种种原因转录水平下降，会偶尔导致溶源性噬菌体进入裂解循环（10-5~10 - 2）。
7）外界因素如紫外线可引起宿主的染色体的破坏，宿主产生应急反应合成具有DNA重组活性的RecA蛋白，导致cI的被降解，噬菌体进入裂解循环。
8）诱发裂解是检查是否存在溶原性细菌的有效方法
第八章
遗传型：是指生物所携带的全部遗传因子及基因，是遗传的物质基础；
表型（表现型）：具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。
表型饰变：同样遗传型的生物，在不同的外界条件下，会呈现不同的表型，但这种表型的差异只与环境有关，表现为暂时性和不可遗传性，并且表现为全部个体的行为！
遗传型变异（基因变异、基因突变）：由于环境因素等的影响，导致遗传物质改变，导致生物特性改变，与表型的饰变相比，这种变异是可以遗传的，而由于遗传物质的变异的频率一般很低，所以这种变异也常常表现为群体中极少数个体的行为（突变频率通常10-6-10-9）。
基因组（genome）一个物种的单倍体的所有染色体及其所包含的遗传信息的总称。
微生物基因组结构的特点：
1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组
1）双链环状的DNA分子（单倍体），2）基因组上遗传信息具有连续性，大肠杆菌和其它原核生物中基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数；一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。3）功能相关的结构基因组成操纵子结构
操纵子（operon）：功能相关的几个基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点（启动子、操作子等）在基因转录时协同动作。4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝，5）.基因组的重复序列少而短；
古生菌的基因组在结构上类似于细菌。但是信息传递系统(复制、转录和翻译)则与细菌不同而类似于真核生物。具体内容在微生物遗传学中学习
2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组?
1）典型的染色体结构
该基因大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。
象所有其它的真核细胞一样，酵母菌的DNA也是与四种主要的组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)结合构成染色质(chromatin)的14bp核小体核心DNA；
染色体DNA上有着丝粒(centromere)和端粒(telomere)，
2）没有明显的操纵子结构，
3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列。
而原核生物中非编码区或内含子均非常少，而人类基因组测序后发现了大量的非编码区，被称为基因组上的荒漠，估计只有5-10%用于编码基因。
4）重复序列多
质粒的检测：
a）　提取所有胞内DNA后电镜观察；
b）　根据质粒的分子大小和结构特征，通过超速离心或琼脂糖凝胶电泳可将质粒与染色体DNA分开
c）　对于常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。（一般将菌点在相应的抗性平板上，若抗性还在，证明质粒可能还在，否则则可能质粒已经丢失，在实验中经常采用这种方法对含质粒的菌株进行初步检测）
d）但这种方法并不保险，因为质粒可能会整和到染色体上，或者细菌由于某种突变而产生抗药性等。
产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）
抗生素
抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌
较广的抗菌谱
通过核糖体直接合成的多肽类物质
一般是次级代谢产物
编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位于质粒或转座子上
一般无直接的结构基因，相关酶的基因多在染色体上
很多细菌能产生能抑制或杀死近缘。甚至同种不同株的细菌的因子（细菌蛋白），被称为细菌素，以和抗生素相区别。抗生素一般具有较广的抗菌谱。此外，抗生素一般是微生物的次级代谢产物（通过代谢过程而产生），而细菌素一般是直接通过核糖体直接合成的多肽类物质。编码细菌素的结构基因及涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质、及赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。细菌素一般根据产生菌的种类进行命名，例如大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。而枯草芽孢杆菌（B. subtilis）产生的细菌素被命名为subtilisin（枯草杆菌素）。等等。
细菌素首先发现于大肠杆菌中，有多种col质粒和产生多种colicins，其发挥作用的原理各不相同。例如，有的colicins从产生菌中释放后，结合到敏感菌细胞膜特定的受体上，而该受体一般是负责一些重要物质，如一些生长因子的运输的；而另外，有些colicins则阻止一些重要的细胞功能的进行。还有一些colicins则在细胞膜上形成通道，造成钾离子和质子的外泄，使细胞失去能化膜而不能产生能量。Colicin E2是一种DNA内切酶，能切断细胞DNA，而colicin E3是一种核酸酶，能在16SrRNA的特定位点进行切割从而使核糖体失活。
由G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与colicins有所不同，但通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。?
诱变剂与致癌物质——Ames试验
原理：诱变剂的共性原则，即化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比：超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用；而90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用
利用细菌突变来检测环境中存在的致癌物质是一种简便、快速、灵敏的方法。可以通过某待测物质对微生物的诱变能力间接判断其致癌能力。
该方法是由美国加利福尼亚大学的Ames教授首先发明，因此又称Ames试验。
该试验是利用鼠伤寒沙门氏菌?(Salmonella typhmurium)的组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变性能来进行的。
普遍性转导中外源DNA的三种后果
1)进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子.
2) 如果转导DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达，就成为流产转导（abortive transduction），其特点是在选择培养基平板上形成微小菌落。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。
3) 3）被降解, 转导失败，在选择平板上无菌落形成。
2.局限性转导(specialized transduction)?
温和噬菌体感染受体菌后，其染色体会整合到细菌染色体的特定位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，例如λ噬菌体，其插入位点的二侧分别是gal和bio基因；
如果该溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体二侧的少数宿主基因，（对λ噬菌体分别是gal和bio基因），会因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上，由此产生了一类特殊的噬菌体----缺陷噬菌体，
缺陷噬菌体除含大部分自身的DNA外，缺失的基因被几个位于前噬菌体整合位点附近的宿主基因取代，这样形成的杂合DNA分子在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。
但该缺陷噬菌体没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。
局限性转导与普遍性转导的主要区别：
1）　被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而完全转导包装的可能全部是宿主菌的基因；
2）　局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。
溶源转变与转导的不同：
1．　温和噬菌体不携带任何供体菌的基因，当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的形状也同时消失
2．　这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；
枯草芽孢杆菌的自然转化模型：
a）　细菌生长在一定的培养条件下生长到一定阶段，以枯草芽孢杆菌为例是在葡萄糖基本培养基中培养到对数生长末期到稳定期，细胞向胞外分泌一种小分子的蛋白质，称为感受态因子，其分子量为5000到10000道尔顿。
b）　当培养液中的感受态因子积累到一定浓度后，与细胞表面受体相互作用，通过一系列信号传递系统诱导一些感受态一特异蛋白质(competence specific protein)表达，其中一种是自溶素(autolysin)，它的表达使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。 c）　DNA以双链形式在细胞表面的几个位点上结合并遭到核酸酶的切割，核酸内切酶首先切断DNA双链中的一条链，被切断的链遭到核酸酶降解，成为寡核苷酸释放到培养基中，另一条链与感受态一特异蛋白质结合，并被引导进入细胞，
d）　进入细胞的外源DNA通过同源重组以置换的方式整合进受体染色体DNA，经复制和细胞分裂后形成重组体。
枯草芽孢杆菌的自然转化的特点：
1）　枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌细胞对双链DNA的吸附和摄取是没有特异性的，转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系，关系越近，则DNA之间的同源性也越高，就越容易在DNA之间发生重组，产生转化子。
2）　自然感受态除了对线型染色体DNA分子的摄取外，也能摄取质粒DNA，但在通常情况下质粒的自然转化效率要低得多，这是因为质粒作为细菌染色体外独立存在的遗传物质和染色体DNA同源性很差（否则会因为和染色体DNA之间的重组而不稳定），这样被切割成单链后进入细胞的质粒DNA将很难通过重组重新恢复成有活性的状态（双链闭合环状），或通过整合进染色体而使相关性状得到表达；如要提高质粒的自然转化效率，可以用二种方法：i）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有活性的质粒的几率大大提高；ii）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-------重组获救。
3）　噬菌体DNA也可被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒，这个过程被称为转染(transfection)，其特点是提纯的噬菌体DNA以转化的（而非病毒感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。
现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染。?
主要有如下几个因素会对微生物菌种的稳定性造成影响：
1．变异：即通过变异而失去重要的遗传特性，例如发酵生产能力下降，或研究中所需要的营养缺陷型由于回复突变等而改变
2．污染：由于微生物在自然界中种类多，分布广，空气、桌面、皮肤表面都有大量的各种微生物存在，因此在进行微生物菌种操作（包括接种、培养等）时非常容易污染，从而造成菌种的丢失。
3．死亡：微生物容易在实验室里用人工配制的各种培养基培养，但如果超过时间不转接菌种，由于疏忽培养条件发生改变，及其它各种以外情况（如冰箱停电）都容易造成菌种的死亡。而且这种损失有时是不可挽回的。
菌种保藏：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱！