一、填空

1．质粒提取中细菌的裂解可采用多种方法，包括：非离子型或离子型去圬剂，有机溶剂，碱或加热处理。

2．用于分离质粒DNA的细菌培养浓度达到0.8×109细胞/ml时，即可通过离心收集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以8000r/min为宜。

3．在分离质粒DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：可以扩增质粒DNA；抑制了菌体的数量，有利于裂解。

4．常使用的质粒纯化方法都利用了质粒DNA相对较小和共价闭合环状两个性质。

5．由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA（SC）的泳动速度最快，一条链断裂的开环状质粒DNA（OC）泳动速度最慢，二条链断裂的线性DNA（L）居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。

6．超离心法纯化质粒DNA时，选用CsCl作介质的优点是：CsCl与不同DNA起反应；CsCl可以自动形成密度梯度，从而使不同分子量的DNA分子得以分开。

7．SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；对RNase、Dnase有一定的抑制作用；SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。

8．碱裂解法所用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的体积比为：2:4:3

9．质粒提取中溶液Ⅱ的主要成分为SDS和NaOH。

10．溶液Ⅲ中钾是3mol/L，乙酸根是5mol/L

11．LiCl可沉淀大量蛋白质和高分子RNA。

12．1OD260=50μg质粒DNA/ml。

13．在碱变形法提取质粒DNA实验中，聚乙二醇用于沉淀质粒DNA。

14．残留在DNA样品中的酚可抑制酶的活性。

15．质粒DNA提取中酚的pH值范围是pH7.8～pH8.0。

16．乙醇沉淀核酸的沉淀混合液中常用的单价阳离子的类型有：乙酸铵、氯化钠和乙酸钠。

17．SSCP电泳方式为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

18．SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的。

19．影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度。

20．SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是：甲酰胺

21．点突变对SSCP检出率的影响不仅仅取决于该点在DNA链上的位置，更取决于该位置对维持立体构象作用的大小。

二、选择

1．质粒提取中溶液Ⅱ的主要成分为：B

A.SDS和EDTA

B.SDS和NaOH

C.EDTA和NaOH

D.SDS和冰乙酸

2．分离质粒DNA时，用蔗糖的目的是：B

A.抑制核酸酶的活性

B.保护DNA，防止断裂

C.加速蛋白质变性

D.有利于细胞破碎

3．关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确？：D

A.溶液Ⅰ的作用是悬浮菌体

B.溶液Ⅱ的作用是使DNA变性

C.溶液Ⅲ的作用是使DNA复性

D.质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性

4．质粒DNA提取中酚的pH值范围：D

A.pH6.5～pH7.0

B.pH8.0～pH8.5

C.pH6.8～pH7.0

D.Ph7.8～pH8.0

5．CsCl-EB密度梯度离心法纯化质粒DNA的原理是：C

A.氯化铯可以较多地插入到线状DNA中去

B.氯化铯可以较多地插入到SC DNA中去

C.EB可以较多地插入到线状DNA中去

D.EB可以较多地插入到SC DNA中去

6．同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：B

A.OC DNA>SC DNA>L DNA

B.SC DNA>L DNA>OC DNA

C.L DNA>OC DNA.SC DNA

D.SC DNA>OC DNA>L DNA

7．用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：C

A.染色体DNA断成了碎片

B.染色体DNA分子量大，而不能释放

C.染色体变性后来不及复性

D.染色体未同蛋白质分开而沉淀

8．1OD260相当于每毫升质粒DNA：A

A.50μg

B.100μg

C.50ng

D.100ng

9．加入溶液Ⅲ后出现的白色絮状沉淀不包括：A

A.质粒DNA和小分子量RNA

B.染色体DNA和高分子量RNA

C.钾离子和SDS

D.蛋白质和细胞膜

10．SSCP电泳方式为：D

A.普通琼脂糖凝胶电泳

B.低熔点琼脂糖凝胶电泳

C.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

D.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

11．SSCP中使DNA双链起变性作用的试剂是：B

A.EDTA

B.甲酰胺

C.溴酚兰

D.Tris-HCl

12．SSCP分离单链DNA片段是依据：B

A.单链DNA分子量大小

B.单链DNA片段空间构象的立体位阻大小

C.单链DNA带电量的大小

D.单链DNA分子量和带电量的大小

三、   是非

1．迄今发现的质粒都是环状的。（错）

2．质粒DNA提取时，溶液Ⅱ需新鲜配置。（对）

3．如果溶菌酶溶液中pH值低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。（对）

4．碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。（错）

5．CsCl-EB密度梯度离心法纯化SC DNA原理是根据EB可以较多地插入到SC DNA中，因而沉降速度较快。（错）

6．酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。（对）

7．氯霉素扩增DNA时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不够，加入时间过迟，菌龄过老，容易自溶。（对）

8．碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不同的。（错）

9．酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。（对）

10．SSCP对长链DNA或RNA的点突变检出率要比短链的高。（错）

11．SSCP分析中非变性PAG电泳分离不能反映出分子量的大小。（对）

12．SSCP可以检测出所有的单点突变。（错）

13．点突变对SSCP检出率的影响取决于该点在DNA链上的位置，点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来。（错）

四、简答

1．简述溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所包含成分及生化作用原理

溶液Ⅰ含葡萄糖和EDTA，葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（Dnase作用时需要一定的金属离子作辅基），另外，EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

溶液Ⅱ含NaOH和SDS，核酸在pH大于5小于9的溶液中是稳定的，但当pH大于12或小于3时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2N，加入抽提液液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒的变性。SDS是离子型表面活性剂，它主要功能有溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋白质结合成为R1-O-SO3-…R2+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用Rnase去除RNA时）受到干扰。

溶液Ⅲ是NaAc-Hac的缓冲液（pH4.8）。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液pH调回中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3MnaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

2．小量制备质粒DNA时发现质粒DNA不能被限制酶所切割，分析可能原因及解决办法。

由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够，没有去除干净导致。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质，如果总是依然存在，可用离心柱纯化DNA。

3．溶菌酶是破碎细菌的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理？

添加DTT、β-巯基乙醇，或8.0mol/L的尿素等增加敏感性。

4．从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法及原理。

方法是先用酚：氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。原理：使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。继而用氯仿抽提可除去核酸制品中残量酚。（此外，酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全抑制RNA酶的活性，它还能溶解带有长poly（A）段的RNA分子。使用酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液可以使这两个问题迎刃而解，）

5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1-0.25M?

在pH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

6．LiCl在质粒DNA提取中的作用是什么？

沉淀大量蛋白质和高分子RNA。

7．简述PCR-SSCP基本过程。

1)PCR扩增靶DNA；

2)将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；

3)将适量单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；

4)最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果，若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断DNA片段中有碱基突变。

8．简述RNA-SSCP的基本原理。

RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上。另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色。

9．SSCP图谱一般是二条单链DNA带，有时可能只呈现一条SSDNA带或三条以上的原因是什么？

主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象，有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。

10．分子量相同的超螺旋环状、带切口环状和线状DNA在凝胶中迁移率大小顺序是什么？

超螺旋环状DNA迁移最快，其次为线状DNA，最慢为带切口环状DNA。

11．影响DNA迁移率的因素有哪些？

影响DNA迁移率的因素有：DNA分子的大小，琼脂糖浓度，DNA的构象，所加电压，温度，嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成。