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血小板贮存损伤研究进展 |
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来源： 作者： 发布时间：2007-03-11
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关键词： 血小板贮存 超微结构 糖蛋白
血小板贮存损伤(ThePlateletStorageLesion,PSL)是指从采血、制备、储存到把血小板用于病人的这一过程中，血小板因受到各种理化因素的影响，形态和功能受到损伤。近年来，临床对血小板的需求不断增加，血小板的制备和储存状况也逐步改善，但是PSL的存在严重影响了血小板的输后体内恢复率及寿命，削弱了临床治疗效果，甚至引起输注无效。因此对PSL机理的研究和预防措施的探索成为输血医学领域的一项重要课题。笔者就近年来对PSL的研究和进展综述如下。
1 血小板超微结构改变
1.1 形态
未活化的血小板呈光滑的双面凸盘状体，直径约3～4μm。按血库标准制备的新鲜血小板，形态发生轻微改变，出现棘突、伪足和弱聚集。这些改变经37°C孵育30min后可逆转［1］。在贮存期间，因活化或新陈代谢衰竭导致血小板膜屏障功能受损，从而引起血小板肿胀甚至溶解。22°C振摇保存24h，约有3%～5%的血小板溶解或气球样变；保存5d，增至5%～10%；若保存不当，受损血小板可达95%［2］。
1.2 贮存颗粒
α-颗粒控制着血小板在血液凝固、炎症修复过程中的功能。保存3d，α-颗粒电子密度下降，部分α-颗粒融合形成大的混合颗粒；保存5d，采用富血小板血浆法制备的浓缩血小板(PRP-PC)中的α-颗粒明显减少，但用白膜法制备的浓缩血小板(BC-PC)中的α-颗粒数量则保持相对稳定。致密体是血小板受到兴奋刺激后发生释放反应的贮存场所，α-颗粒和致密体通过与开放管道系统(OCS)融合进行释放。在颗粒释放的同时，血小板表面糖蛋白GMP-140表达增强，这一特性可用来评估浓缩血小板在制备和保存过程中活化的程度。在α-颗粒中，有许多物质并非源自巨核细胞或由血小板自身合成，而是从血浆吞噬而来，故可推测，贮存血小板输到体内后，α-颗粒可通过细胞摄粒作用而得到恢复［3］。
1.3 OCS
OCS是血小板特有的内膜系统，由外部浆膜内陷构成，贯穿整个血小板形成许多管腔。OCS具有“双行道大街”的作用，即血浆与血小板内部进行物质交换的通道。除摄入和分泌作用外，OCS还是伪足伸延的膜贮备场所。新鲜血小板的OCS管腔直径很小，随保存时间延长逐渐增大。这由于α-颗粒与OCS融合引起了OCS肿胀。在保存3d以上的血小板中可观察到α-颗粒与OCS融合的现象，随保存时间延长，血小板中的OCS逐渐减少，溶解了的血小板中不再有OCS［1］。
1.4 细胞骨架
血小板中的肌动蛋白和肌凝蛋白微丝组成细胞骨架，在血小板的变形、颗粒释放、伸展和血块收缩中起着重要作用。在释放反应中肌动蛋白与α-颗粒膜蛋白结合，参加颗粒的能量依赖性运输。随着保存时间的延长，血小板代谢能力耗尽，运输颗粒到浆膜外层的能力丧失，肌动蛋白的Ca2＋依赖性蛋白水解导致了膜骨架功能损伤，浆膜脂质双层稳定性下降，血小板对内皮细胞产生强有力的粘附，微泡增多，膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)暴露到膜表面，形成血小板3因子(PF3)，促使因子X活化和凝血酶原转变为凝血酶。血小板保存5d后，PF3活性可增加12倍，血小板出现广泛聚集［4］。
2 血小板功能及代谢的改变
2.1 糖蛋白GPⅡb/Ⅲa与血小板聚集功能
在制备和保存过程中血小板受到各种刺激被活化，GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白和其它粘连蛋白(如vWF)结合，引起血小板骨架结构改变，在血小板之间形成蛋白桥链，促成血小板聚集，故血小板聚集试验可用来评估PSL。初期的血小板聚集反应具有可逆性，保存几天后，血小板新陈代谢耗尽，PSL逐渐发生。保存5d的浓缩血小板用ADP刺激，不发生聚集反应；然而加入新鲜血浆孵育之后，聚集部分恢复。这是由于新鲜血浆除提供基本能量外，还补充了某些在保存中丧失了的未知成份。由此可见，贮存血小板输到体内后能适度恢复其生理功能和生存能力。
2.2 血小板膜脂质
血小板脂膜双层主要由磷脂组成。各种磷脂在质膜两侧呈不对称性分布，未活化前主要是神经鞘磷脂(SPH)，部分磷脂酰胆硷(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)分布在外层；而80%的磷脂酰肌醇(PI)和90%以上的磷脂酰丝氨酸(PS)分布在内层。当血小板活化时，PS转向细胞膜外侧面，为血浆凝血因子的活化提供了催化性脂质表面，即PF3。这种血小板磷脂的动态分布对血液凝固具有限速的作用。在贮存期间，所有磷脂都有规律地减少，但磷脂分布特征维持不变。Koerner等［5］用流式细胞仪检测发现，丧失的磷脂(如PF3)主要与大微泡结合，而这些微泡的表面有GPⅡb/Ⅲa和Ⅰb，认为在贮存期间由于血小板活化导致了微泡的形成。在血小板磷脂丧失的同时，磷脂功能也部分丧失，22°C保存5d，血小板脂质功能下降＞50%。因此PSL与脂质的丧失和功能下降有关。
3 PSL的影响因素及预防
3.1 制备技术
目前采用三种方法制备浓缩血小板。①PRP法：由于供者红细胞压积(Hct)个体差异，在第一次离心时(轻离心)，血细胞受到的离心力不稳定，很难达到一致的标准，所以约有30%～40%的PRP受到其它细胞严重污染；第二次离心时为把血小板压积到袋底，采用了重离心，常常引起血小板不可逆转的聚集，使血小板功能遭受损害。提示：“血小板与袋壁的相互作用”可能是引起血小板活化的一个重要因素［5］。②BC法：第一次离心(重离心)，血小板被压积在红细胞“垫子”上，而不是在粗糙的塑料袋表面，这样可以减少血小板活化，并可提取80%以上的血小板和白细胞；第二次离心(轻离心)可以把4～5袋白膜悬液混合到一块，使其具有稳定的Hct，离心时血小板经受的离心力更为均匀。因此BC-PC被活化比较少，聚集状态和细胞污染都较PRP-PC少，产品含量较一致。③单采血小板：用血液成分分离机采集的血小板受到不同的采集和分离切应力、塑料袋表面、再悬浮血小板时用力搅动等影响，使血小板在保存期间的稳定性下降。由于机型不同，产生的影响也各不相同，在此不作详细阐述。
3.2 贮存温度和时间
血小板在4°C贮存，恢复率和存活率均低于22°C贮存。在4°C冷诱发的PSL表现为微管消失、ATP丧失、血小板收缩蛋白损耗，最终引起血小板盘状形态不可逆地丧失。血小板在37°C保存，存活率较22°C保存低，这是因为血小板在22°C代谢率较低的缘故。37°C保存血小板，细菌污染引起的败血症发生率较高。目前普遍认为血小板在具有良好透气性的塑料袋中，22°C振摇保存最为理想［6］。值得注意的是血小板在22°C保存＞5d，细菌污染的危险性增加，因此适当减少血小板的贮存时间，对预防细菌污染和减少贮存损伤是有利的。
3.3 贮存容器
第一代血小板保存袋用的是较厚的PVC材料，增塑剂为DEHP。这种保存袋透气性较差，增塑剂释放的有毒化合物MEHP能抑制磷脂酶A2，削弱血小板聚集反应，并能产生心脏毒素。近年来为血小板保存设计了专用袋。新一代的血小板保存袋采用了透气性好、难溶于血浆的TRHTM材料和柠檬酸盐基增塑剂。血小板通过三羧酸循环能将柠檬酸盐基增塑剂转变成无害的化合物而代谢［7］。
3.4 贮存介质
80年代首次报道了在非血浆介质中保存血小板，目的是为了节约血浆，减少因输血浆蛋白引起输血反应的危险。近年来，人们采用醋酸盐作为保存液成分，发现在三羧酸循环中醋酸盐的氧化消耗能提供血小板需要的ATP，降低糖酵解速度。醋酸盐还能利用氢离子使浓缩血小板悬液的pH保持稳定［8］。需要指出的是：保留＞15%的自体血浆对血小板完善保存是非常必要的。因为血浆太少将无法维持缓冲能力和葡萄糖水平，对血小板贮存不利。
3.5 残余白细胞的影响
3.5.1与血小板竞争血浆中的营养，可加速PSL。
3.5.2 释放各种酶和细胞分裂产生的生物活性物质，引起受血者产生输血反应［9］。
3.5.3 直接产生有害影响，如引起HLA同种免疫和巨细胞病毒感染等。采用白细胞滤过器清除白细胞，可减少部分影响，但对血小板贮存的稳定性会产生不利影响［10］。在采血后24～48h内，血液中的白细胞对全血和浓缩血小板悬液的杀菌体系具有重要意义，粒细胞能清除存在于皮肤表面并在静脉穿刺时带到血袋中的细菌。从理论上讲，早期过滤白细胞可能使浓缩血小板悬液更易生长细菌。但是1997年Soeterboek等［11］报道了荷兰三家血库1994、1995年两年血液制品无菌试验结果，表明：去除白细胞的血液制剂其污染率比未去除白细胞的血液制剂低，结论是去除白细胞可降低细菌污染率，这可能是由于随着WBC清除，微生物也同时被清除的缘故。
4 PSL的评估
近年来采用多种技术手段评估PSL［12，13］。①用自动细胞计数仪分析血小板体积、形态和聚集状态，对评估血小板贮存期形态的动态改变和聚集状态具有意义。当小聚集存在时(2～3个/组)，血小板体积分布模式右移，MPV(平均血小板体积)增高；大聚集存在时，柱状图显示有假红细胞或假白细胞(聚集的血小板)；当血小板中微泡和碎片增加时，血小板体积分布模式左移；带有大量细胞碎片时，MPV＜3.8fl。另外，MPV增高与血小板pH下降密切关系。②用计数仪连续计数，观察血小板自发性聚集，其特征为血小板计数下降，MPV、假白细胞增加。由于血小板对自发聚集的高灵敏性，故可用此法筛选血小板最佳制备方案。③血小板功能试验：采用dMPV(MPV差值)检测法可提高测定PSL的敏感度，确定血小板损伤状况，推测血小板生存能力，是一种简单可靠的方法。④vWF的释放：vWF是确定PSL理想标记物，它的异常与止血功能障碍有关。采用定量流式细胞计数的方法，根据血小板微泡与vWF∶Ag结合的情况可区分活化了的血小板；或通过单克隆抗体对vWF指示瑞斯托菌素辅助因子结合位点，能够对vWF在PSL发展中介入蛋白水解的情况进行准确的定义。⑤血浆中可溶性血小板糖蛋白的测定：采用流式细胞仪可测定血小板膜糖蛋白的表达。血小板活化可导致血小板膜某些糖蛋白表达增强，贮存5dPRP-PC中的残余白细胞［(0.35～0.39)×109/单位］能促使血浆中可溶性血小板糖蛋白提高10倍，故血小板活化标记物GPⅠb,GPⅡb/Ⅲa，GMP140和其它糖蛋白在血小板表面的表达是近年来对PSL性质分析的注意焦点。
5 发展趋势
现代输血领域中血小板疗法的最新概念是“越纯越好”，这有利于减少不应性和发热反应。进行自体造血祖细胞体外定向扩增和利用基因工程技术克隆重组人类促血小板生成素(Thrombopietin,rhTPO)，刺激巨核细胞生成和血小板产生，用于严重血小板减少症，使临床浓缩血小板需求的增加减缓；对血小板进行光照消毒，生产失活病毒、细菌的浓缩血小板［14］；生产冻干血小板，这种血小板对保存条件几乎无要求，只需在输注前加入适量的缓冲液，以恢复原来的水分；通过对血小板在贮存期间的改变和与机体内部功能的关系的研究，改善血小板制备和贮存条件，提高质控标准，加强对供血者筛选，使血液成份加工过程更为先进，使血小板贮存损伤最小化。 参考文献
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