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关键词： 巨噬细胞 肺泡 一氧化氮合酶 肿瘤
活化的巨噬细胞(M)在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮(NO)作为活化的M的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用［1］。本研究通过测定肺M内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及其产物NO水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺M对肿瘤细胞杀伤作用的影响，旨在探讨肺M NOS活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺M在抗肿瘤免疫中的地位。
1 材料和方法
1.1 肺M的制备及培养 体质量20～25 g的纯种C57雄性小鼠32只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,随机分成实验组和对照组，每组16只，均经腹腔注入2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉放血处死,暴露颈部气管后,用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次1 ml,共15次。将回收的灌洗液以1 500 r/min离心10 min,弃上清,用含10%小牛血清的最低必需培养液(MEM)配成 1×106个/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中,37℃,5% CO2培养2 h,洗去未贴壁细胞,根据需要分别加入不同剂量(50，100，150，200 U/ml)的干扰素γ（INFγ）,继续培养24 h。
1.2 肿瘤细胞培养上清液的收集 将无菌取得的肥大细胞肿瘤细胞 P815 (上海肿瘤研究所提供)以 5×105个/ml的密度培养在RPMI 1640培养液中,置37℃,5% CO2培养箱培养48 h, 2 500 r/min离心20 min,取上清液,置-20℃保存待用。
1.3 iNOS活性测定 用Smith薄层层析法［2］测定上清液培养标本中瓜氨酸 (citrulline)的生成量，以此反映iNOS的活性。
1.4 NO测定 10 mmol/L硼酸钠溶液系列稀释10 mmol/L亚硝酸钠，测定其相应于波长为545 nm时的光密度(D)值,作曲线,并得出直线回归方程式［3］。取上清培养液，加入等量的Greiss试剂（1%磺胺、0.1%萘乙二胺、2.5%磷酸),室温放置10 min，545 nm比色，根据直线回归方程计算出NO含量。
1.5 肺M肿瘤杀伤活性测定 在培养板内加入肺M悬液 100 μl/孔，实验组再加入2 mmol/L NG单甲基左旋精氨酸（L-NMMA，Sigma公司），50 μl/孔，置37℃，5% CO2培养箱培养 4 h，再加入含10% P815上清液的营养液 100 μl/孔，置37℃,5％CO2培养72 h。每孔加二甲基亚砜(DMSO) 100 μl,混匀静置20 min,在PG-3022酶联仪上用570 nm波长测定D值,计算肿瘤细胞生长抑制率。
1.6 统计学处理 所有数据采用X±s表示，组间显著性检验用配对资料t检验，各指标进行直线相关分析。
2 结果
2.1 不同剂量INFγ对肺M产生NO的影响 不同剂量的 INFγ与活化的肺M共同培养24 h后,培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高(图1),且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P＜0.01)。
图1 INFγ对肺巨噬细胞NO产生和iNOS活性的影响
fig 1 The effect of INFγ on NO production and
activity of iNOS by macrophages
●: NO; ▲: iNOS
2.2 INFγ对肺M NOS活性的影响 不同剂量INFγ作用于肺M后，肺M iNOS活性随INFγ剂量的增加而升高（图1）,与INFγ的剂量有明显的相关性(r=0.990, t=19.78，P＜0.01)。
2.3 L-NMMA对肺M肿瘤杀伤活性的影响 活化的肺M与P815单独作用时，其培养上清液中NO的浓度为(18.47±5.00) μmol/L，而预先加入 L-NMMA再培养的上清液中NO浓度为(11.07±4.06) μmol/L，两组之间有显著性差异(P＜0.05)；未加L-NMMA组肺M对P815细胞生长的抑制率为66.6%，预先加入 L-NMMA组为43.3%，较前者明显降低［两组D(570)值分别为0.132±0.032和0.292±0.065，P＜0.05］。
3 讨论
NO由L-精氨酸经NOS作用而生成。NOS主要有两种同工酶：结构型(constitutive, cNOS)和诱导型（inducible,iNOS)。M、库普弗细胞是 iNOS的主要表达细胞，因此从肺M内测得的为iNOS［4］。某些细胞因子，如INFγ、TNFα、IL-2等可诱导iNOS的活性，增加NO的合成［5］。
活化的M具有杀伤肿瘤细胞的能力,其作用机制是多样的,可能是通过细胞间的联接或是依赖于一种或多种细胞毒效应分子，包括IL-2、过氧化氢、TNF等。自1985年发现活化的M可产生NO以来［6］，随着有关NO研究的深入，越来越多的结果表明NO与活化M杀伤肿瘤细胞的作用密切相关。Hibbs等［7］首先发现在缺乏精氨酸的培养条件下，活化的M的细胞毒效应作用不能表达，由此推测精氨酸的分解代谢产物NO是活化的M的细胞毒效应分子。以后的研究证实了NO具有抑制细胞生长和细胞毒性作用。本研究发现，活化的肺M可以产生NO，并对肿瘤细胞 P815有杀伤作用；在加入作为 NOS的竞争性抑制剂的L-NMMA后，NOS代谢产物NO减少，对 P815的杀伤作用也相应减弱，从而也证实了由iNOS催化产生的NO是活化的肺M杀伤肿瘤细胞的一个重要的效应分子。
NO介导杀伤肿瘤细胞的机制可能是其与铁硫键（Fe-S）基团作用，形成铁-亚硝基复合物，从而引起顺乌头酸酶(aconitase)和线粒体呼吸链上的复合物Ⅰ与复合物Ⅱ中的 Fe-S辅基的纯化与降解，从而引起细胞毒性［8］。肿瘤细胞内铁的大量丧失，破坏了许多代谢酶的活性，因此可阻断肿瘤靶细胞的能量代谢和 DNA复制。同时活化的M产生的NO可通过促进细胞内 cGMP的升高来诱导并促进细胞凋亡的发生，从而抑制肿瘤细胞生长或引起肿瘤细胞的凋亡［9］。
综上所述，肺M内iNOS及其代谢产物NO与肺M肿瘤杀伤作用之间存在着明显的关系，通过各种手段提高肺M NO的产生，可能为肺癌的治疗提供一条新的途径。 参考文献
1 Cui S, Reichner JS, Mateo RB, et al. Activated murine macrophages induce apoptosis in tumor cells through nitric oxide- dependent or -independent mechanisms［J］. Cancer Res，1994,54 (9)：2462
2 Smith SD, Wheeler MA, Weiss RM. Nitric oxide synthase: an endogenous source of elevated nitrite in infected urine［J］. Kidney Int, 1994,45(2):586
3 Wang W, Keller K, Chadee K. Entamoeba histolytica modulates the nitric oxide synthase gene and nitric oxide production by macrophages for cytotoxicity against amoebae and tumour cells［J］. Immunology, 1994,83(4):601
4 Langrehr JM, Hoffman RA, Lancaster JR,et al. Nitric oxide ??a new endogenous immunomodulator［J］. Transplantation,1993, 55(6):1205
5 Sanchez-Bueno A, Verkhusha V, Tanaka Y, et al. Interferon-γ-dependent expression of inducible nitric oxide synthase, interleukin-12, and interferon -γ- inducing factor in macrophages elicited by allografted tumor cells［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1996,224(2):555
6 Stuehr DJ, Marletta MA. Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1985,82(22):7738
7 Hibbs JB Jr, Taintor RR, Vavrin Z. Macrophage cytotoxicity: role for L-arginine deiminase and iminonitrogen oxidation to nitrite［J］. Science,1987,235(4787):473
8 Sarih M, Souvannavong V, Adam A. Nitric oxide synthase induces macrophage death by apoptosis［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1993,191(2):503
9 Shimaoka M, Iida T,Ohara A, et al. NOC,a nitric-oxide-releasing compound, induces dose dependent apoptosis in macrophages［J］. Biochem Biophys Res Commun，1995,209(2):519
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